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Jun 21, 2023

Genoma bipartito y organización estructural del parvovirus Acheta domesticus densovirus segmentado

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3515 (2023) Cita este artículo 897 Accesos 17 Detalles de métricas altmétricas Los parvovirus (familia Parvoviridae) se definen actualmente por una línea lineal.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3515 (2023) Citar este artículo

897 Accesos

17 altmétrica

Detalles de métricas

Los parvovirus (familia Parvoviridae) se definen actualmente por un genoma de ADN monopartito lineal, cápsidas icosaédricas T = 1 y casetes de expresión de proteínas estructurales (VP) y no estructurales (NS) distintos dentro de su genoma. Presentamos el descubrimiento de un parvovirus con genoma bipartito, el densovirus segmentado Acheta domesticus (AdSDV), aislado de grillos domésticos (Acheta domesticus), en el que es patógeno. Descubrimos que el AdSDV alberga sus casetes NS y VP en dos segmentos del genoma separados. Su segmento vp adquirió un gen que codifica la fosfolipasa A2, vpORF3, mediante recombinación intersubfamiliar, que codifica una proteína no estructural. Demostramos que el AdSDV desarrolló un perfil de transcripción altamente complejo en respuesta a su estrategia de replicación multipartita en comparación con sus ancestros monopartitos. Nuestros exámenes estructurales y moleculares revelaron que el AdSDV empaqueta un segmento del genoma por partícula. Las estructuras crio-EM de dos poblaciones de cápside vacía y una población de cápside llena (resolución de 3,3, 3,1 y 2,3 Å) revelan un mecanismo de empaquetamiento del genoma, que involucra una cola C-terminal alargada de la VP, que "fija" el genoma de ADNss a la Interior de la cápside en el doble eje de simetría. Este mecanismo difiere fundamentalmente de las interacciones cápside-ADN observadas anteriormente en los parvovirus. Este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre el mecanismo detrás de la segmentación del genoma ssDNA y sobre la plasticidad de la biología del parvovirus.

Los parvovirus (PV) son pequeños virus icosaédricos sin envoltura que infectan a animales vertebrados e invertebrados1. Los densovirus (DV) son miembros de la familia Parvoviridae que se replican de forma autónoma y que infectan a los invertebrados, clasificados en dos subfamilias2. Los miembros de la subfamilia Densovirinae infectan una amplia gama de invertebrados terrestres y acuáticos, en los que son patógenos (revisado por Penzes et al.3). Los PV de la subfamilia Hamaparvovirinae infectan a vertebrados o invertebrados, y los DV hamaparvovirales se clasifican en tres géneros. Los miembros de los géneros Penstylhamaparvovirus y Hepanhamaparvovirus infectan a los camarones peneidos y son patógenos3,4. Los miembros del género Brevihamaparvovirus infectan exclusivamente a mosquitos y están estrechamente relacionados con los penstylhamaparvovirus, como lo sugiere su organización genómica, homología de proteínas y estrategia de transcripción5,6,7,8,9.

Los miembros de Parvoviridae tienen genomas de ADNss monopartitos lineales de 3,6 a 6,2 kb10, flanqueados por estructuras secundarias de ADN parcialmente bicatenarias en forma de horquilla, que pueden formar repeticiones terminales invertidas (ITR)10,11. Los extremos son esenciales para la replicación y el empaquetado del genoma10,11. El genoma del parvovirus incluye dos casetes de expresión, uno de los cuales codifica un número variado de proteínas no estructurales (NS). Al menos una de estas proteínas, convencionalmente denominada NS1, contiene un dominio de helicasa de la superfamilia 3 (SF3), que incluye los únicos motivos de secuencia de proteínas altamente conservados en toda la familia2,10. El otro casete de expresión, denominado cap, codifica de una a cuatro proteínas estructurales (VP). Suelen ser extensiones N-terminales entre sí, que comparten un segmento C-terminal superpuesto y se ensamblan en la cápside10,12. En el caso de las subfamilias Parvovirinae y Densovirinae, la extensión N-terminal única de la proteína 1 de la cápside menor (VP1u), la más grande de las VP, normalmente codifica un dominio de fosfolipasa A2 (PLA2) altamente conservado, esencial para la salida endosomal13,14. Después de la endocitosis mediada por receptores, para llegar al núcleo para replicarse, se ha demostrado que las PV circulan a través del sistema endolisosomal de la célula huésped, exponiendo la partícula viral a una acidez creciente desde pH 7,4 a 4,014,15,16,17. ,18,19. Algunos parvovirus, incluidos todos los miembros de Hamaparvovirinae, carecen de actividad PLA2 y utilizan un mecanismo de salida endosomal alternativo19.

Hasta la fecha, se han determinado más de cien estructuras de cápside parvovirales con resolución atómica o cerca de ella, la mayoría pertenecientes a Parvovirinae, a diferencia de solo cinco derivadas de DV. Tres de estas estructuras de cápside pertenecen a miembros de Densovirinae, incluido Galleria mellonella densovirus (GmDV) con una resolución de 3,7 Å (PDB ID: 1DNV)20 del género Protoambidensovirus, Acheta domesticus densovirus (AdDV) con una resolución de 3,5 Å (PDB ID: 4MGU) del género Scindoambidensovirus21 y Bombyx mori densovirus (BmDV) con una resolución de 3,1 Å (PDB ID: 3P0S) del género Iteradensovirus22. La estructura de la cápside de Penaeus stylirostris densovirus (PstDV) con una resolución de 2,5 Å (PDB ID: 3N7X) del género Penstylhamaparvovirus23 es la única estructura de alta resolución de Hamaparvovirinae hasta la fecha. La quinta estructura pertenece al metalodensovirus divergente Penaeus monodon (PmMDV) con una resolución de 3 Å (PDB ID: 6WH3), que carece de afiliación a una subfamilia19. Todas las estructuras PV poseen simetría icosaédrica T = 1, compuesta por 60 subunidades VP. Cada subunidad muestra un pliegue en rollo de gelatina de ocho hebras (βB a βI)24, en el que bucles variables unen las hebras β para componer la morfología variable de la superficie de la cápside12. Con la exención de PmMDV, la lámina BIDG del rollo de gelatina interior se complementa con una hebra β N-terminal adicional, canónicamente denominada βA12,19. El eje de simetría quíntuple de la cápside PV incluye característicamente una abertura similar a un poro que continúa en un canal, un portal propuesto para ayudar al empaquetado y desenrecubrimiento del genoma, así como para la externalización del dominio PLA225,26,27.

El grillo doméstico común (Acheta domesticus) alberga 2 DV de la subfamilia Densovirinae. AdDV es altamente patógeno y causa mortalidad masiva en instalaciones de cría de grillos en todo el mundo28,29. El AdDV alberga un genoma ambisentido, que incluye un gen VP "dividido", una característica del Scindoambidensovirus. En consecuencia, su VP1 está codificado por una transcripción empalmada, en la que el VP1u que contiene PLA2 se expresa mediante un ORF separado (cap1) aguas arriba de cap2, dando lugar este último a las VP 2 a 4 mediante escaneo con fugas28. El mini ambidensovirus Acheta domesticus (AdMDV), del género Miniambidensovirus, también alberga una estrategia de expresión ambisentido, pero solo incluye una tapa, que codifica un VP130 que abarca PLA2.

Se informa del descubrimiento, la secuencia completa del genoma, la estrategia de transcripción y la estructura 3D casi atómica de un DV no descrito previamente que infecta al grillo doméstico común, denominado densovirus segmentado Acheta domesticus (AdSDV). Hasta ahora, AdSDV es el primer PV que alberga un genoma bipartito, resultado de la recombinación entre las subfamilias Densovirinae y Hamaparvoviriane. Mostramos que cada segmento está empaquetado en una partícula viral separada, para mantener el tamaño de partícula y la integridad de sus ancestros Brevihamaparvovirus. El AdSDV tiene una estrategia de transcripción compleja, distinta de otros miembros de su género Brevihamaparvovirus, una posible adaptación a la estrategia de replicación multipartita. Además, AdSDV se basa en un modelo único de empaquetado de ADN, que involucra los ejes triple y doble y da como resultado una mayor termoestabilidad de los viriones completos, al reforzar el eje doble mediante interacciones de apilamiento directo entre la pared interior y el genoma de ADN ss. Este estudio de AdSDV proporciona nuevas perspectivas sobre el genoma parvoviral y la evolución de la transcripción, así como sobre la arquitectura de la cápside.

En febrero de 2013, grillos domésticos comunes en un centro de cría de insectos en Ontario, Canadá, mostraron signos clínicos compatibles con una infección viral, es decir, movimientos erráticos e incontrolados, seguidos de parálisis y muerte. Las partículas virales icosaédricas, de ~ 220 Å de diámetro, se pudieron visualizar en cuerpos grasos homogeneizados de muestras afectadas mediante microscopía electrónica de tinción negativa (Fig. 1a). La presencia de DV conocidos o virus de ADN CRESS de tamaño y morfología similares se excluyó mediante pruebas de PCR. Después de la purificación en gradiente de densidad de CsCl, las partículas se introdujeron mediante la administración oral de alimentos contaminados a ninfas sanas de grillos domésticos. Estos desarrollaron signos idénticos en 14 a 20 días como el brote original, mientras que la inyección directa de las partículas purificadas en el cuerpo adiposo abdominal aceleró la progresión de la enfermedad en aproximadamente 7 días. Estos experimentos se repitieron con otras dos especies de grillos criados comercialmente, es decir, Gryllus bimaculatus y Grylloides sigillatus, pero ninguno mostró signos de infección ni albergaba partículas virales en cuerpos grasos homogeneizados. El ADN aislado no pudo amplificarse mediante amplificación por círculo rodante, lo que sugirió un genoma lineal. En consecuencia, el ADN extraído fue despuntado, clonado y secuenciado.

a Partículas del virus icosaédrico visualizadas en los cuerpos grasos homogeneizados de grillos domésticos comunes (Acheta domesticus) infectados mediante microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa. Esta es una micrografía representativa de diez tomadas en ese momento, cada una de las cuales muestra las partículas en números similares. b Imagen de gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra los resultados de la digestión mediante endonucleasas de restricción que cortan solo el segmento NS, VP o ambos. Este es un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio representativo de tres de estos experimentos, que muestra los mismos resultados. c Predicciones de la estructura secundaria del ADN de los extremos del genoma en forma de T, que flanquean el segmento NS y VP. d Organización del genoma y estrategia de transcripción del segmento NS. Los marcos de lectura abiertos (ORF) están marcados con flechas y cuadros de colores, el ARNm está estilizado por líneas negras. Los pequeños marcos de lectura abiertos, que funcionan como exones, pero carecen de un codón de inicio ATG canónico, están marcados con un asterisco (*). Las líneas onduladas marcan señales de poliadenilación. Los promotores están etiquetados como "P", los sitios donantes y aceptores como "D" y "A", respectivamente. Debajo de los promotores se muestra la secuencia del sitio de inicio de la transcripción, con el extremo 5' del ARNm real presentado en negrita detrás de la línea vertical. A la derecha se muestran los pesos moleculares estimados de los productos proteicos que expresará cada transcripción. e Organización del genoma y estrategia de transcripción del segmento VP, utilizando el mismo esquema de visualización y etiquetado que en d.

La secuenciación identificó dos poblaciones clonadas, ambas de ~3,3 kb de tamaño. Para verificar si ambos estaban presentes en el ADN viral extraído, el ADN nativo y romo se sometió a digestión con endonucleasas de restricción (RE) mediante enzimas con sitios de reconocimiento solo en una (HindIII, SpeI) o en ambas (XbaI) secuencias obtenidas (Fig. 1b). ). Los perfiles de restricción resultantes respaldaron la presencia de un aislado de ADN bipartito heterogéneo. Ambos segmentos (segmento I y II) estaban flanqueados por estructuras secundarias en forma de T en forma de horquilla de 208 y 220 nt, respectivamente, que no formaban ITR pero eran idénticas en los extremos correspondientes de ambos segmentos, lo que implica un origen genómico común ( Figura 1c). El segmento I (3316 nt de longitud) albergaba tres ORF completos y dos parciales (Tabla S1, Fig. 1d). El aminoácido derivado (aa) del segmento I identificó dos proteínas de 796 y 379 aa de longitud, respectivamente, que mostraban una similitud significativa con NS1 y NS2 de varios brevihamaparvovirus que infectan mosquitos según un BLASTP (proteína de herramienta básica de búsqueda de alineación local). 31 (NS1: 41% de identidad con 69% de cobertura, Haemagogus equinus DV; NS2: 41% de identidad con 97% de cobertura, Aedes albopictus DV 2), por lo que el segmento I fue designado segmento ns. El ORF más largo, ahora denominado NS1, albergaba un dominio de helicasa SF3. El nsORF3 de 26 aa de largo no albergaba ninguna homología detectable con ninguna proteína conocida. El segmento II (3332 nt) incluía tres ORF (Tabla S1, Fig. 1e) y se designó segmento vp, ya que se predijo que vpORF1 codificaría una proteína de 378 aa de largo, un homólogo de un VP de Brevihamaparvovirus de Aedes albopictus DV 2 ( 40% de identidad con 83% de cobertura). El supuesto producto de 104 aa de largo del pequeño ORF central, vpORF2, no mostró ninguna homología significativa con ninguna entrada de GenBank. El supuesto producto de vpORF3 de 347 aa de largo se identificó como un homólogo de la cap1 que codifica VP1u de AdDV (45% de identidad con 67% de cobertura). En consecuencia, ORF3 también alberga un dominio PLA2, de manera similar al Scindoambidensovirus VP1u. Segmento 2. Debido al genoma bipartito, este DV se denominó densovirus segmentado de Acheta domesticus (AdSDV).

Basado en la inferencia de filogenia del dominio de helicasa SF3 conservado en toda la familia, AdSDV se agrupó en el género Brevihamaparvovirus de la subfamilia Hamaparvovirinae, convirtiéndose en el primer miembro que no infecta mosquitos y el primero en albergar un dominio PLA2 (Fig. 2).

Cada secuencia representa una especie, mientras que la subfamilia Parvovirinae está colapsada para su visualización. Los nombres de los géneros se muestran en las ramas y los valores de probabilidad posterior para evaluar la confiabilidad de la topología se muestran como etiquetas de nodos. También se muestra un código de colores de las formas de los nodos, según los valores de probabilidad posteriores. Los grillos domésticos que infectan los densovirus están resaltados en color albaricoque y etiquetados con la silueta del animal. Acheta domesticus agrupa grupos de densovirus segmentados dentro del género Brevihamaparvovirus que infecta a los mosquitos y está resaltado en amarillo.

Para caracterizar el transcriptoma del genoma bipartito, se aisló ARN total de grillos domésticos infectados, tres días después de la inoculación directa del cuerpo graso, luego se transcribió de manera inversa y se sometió a amplificación específica mediante PCR. Ambos segmentos albergaban dos promotores y dos señales de poliadenilación, respectivamente (Fig. 1d, e). El promotor del segmento ns aguas arriba en la unidad de mapa 12 (P12) produjo dos transcripciones y ambas están poliadeniladas en la señal de poliadenilación proximal (ubicada en 2551 nt, la cola se agrega en 2612 nt). La transcripción 1 es capaz de expresar el NS2 completo en toda su longitud y no se sometió a empalme. La transcripción empalmada 2 utilizó el sitio donante aguas arriba (D1, ATC | CA), vinculándolo con el sitio aceptor proximal (A1, TTATCAA | AA), eliminando el intrón NS 1 (Tabla S2, Fig. S3). Esto da como resultado un ORF, NS1-N1, que puede expresar la región N-terminal de NS1, terminando el marco directamente aguas arriba del dominio SF3, al recibir una cola de 7 aa de largo de un ORF pequeño sin un codón de inicio ATG. Hay cuatro transcripciones NS transcritas desde el promotor aguas abajo, P21, que terminan en la señal poliA distal (ubicada en 2865 nt, la cola poliA se agrega en 2880 nt). La transcripción 3 no empalmada es capaz de expresar un ORF NS1 truncado en el extremo N, traducido del segundo ATG del marco original, ubicado en un contexto Kozak fuerte (CCGCCATGG). Con un peso molecular previsto de 74 kDa, esta es la única proteína derivada del segmento NS, que incluye el dominio helicasa SF3 completo. Ya sea a partir de esta transcripción, o de una supuesta transcripción 4, también podría expresarse un producto NS2 truncado en el extremo N (NS2-C), utilizando el segundo codón ATG del marco NS2, ubicado en un contexto Kozak más débil (ACACATGA). La transcripción empalmada 5 utilizó un conjunto distinto de sitios donantes y aceptores de los de la transcripción 2, a saber, D2 (GCA | AG) y A2 (GGGAGCA | GAG) (Tabla S2, Fig. S3). La eliminación del intrón 2 NS pone en marco un pequeño ORF auxiliar, ORF3, con la porción C-terminal del ORF NS1, que potencialmente codifica el NS1-C de 20 kDa. En cuanto a la transcripción 4, la existencia de la transcripción 6 como una población de ARNm separada es discutible. La eliminación del mismo intrón da como resultado la unión del ORF NS1 con una cola de 25 aa de largo de otro ORF pequeño que carece de ATG, dando lugar a NS1-N2. Según el perfil de transcripción, el segmento ns de AdSDV tiene una capacidad potencial de codificación para seis supuestas proteínas NS.

El segmento vp también codificó dos promotores (P12, P42) y dos señales de poliadenilación, lo que resultó en la separación del ORF1 similar a Brevihamaparvovirus y el ORF3 similar a Scindoambidensovirus, junto con el ORF2 auxiliar, en dos unidades de expresión separadas. La expresión de vpORF1, a partir del transcrito 1 no empalmado, está bajo el control de P12 aguas arriba y está poliadenilada en el sitio PolyA1, directamente aguas arriba del codón de inicio ATG de vpORF3 (en la posición 1844 nt, cola de poliA agregada en la posición 1852 nt). La transcripción 2, la única transcripción no empalmada del P42 aguas abajo, es potencialmente capaz de expresar el ORF3 que codifica PLA2. Las transcripciones empalmadas 3 y 4 compartieron el mismo sitio donante (GAA | GA) pero utilizaron sitios aceptores separados, A1 (TATTATA | AAC) y A2 (CAAAAAA | GAC), respectivamente (Fig. S3). Mientras que la transcripción 3 une vpORF2 con un vpORF3 casi completo, la eliminación del intrón más largo de la transcripción 4 solo preserva la porción C-terminal de este ORF, eliminando la región que codifica PLA2.

Utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac, se transfectaron cultivos de Sf9 mediante tres construcciones de bácmidos recombinantes, a saber, AdSDV-Bac-vpORF1 y AdSDV-Bac-vpORF3, con un vpORF1 o vpORF3 unido a un promotor de poliedrina, respectivamente, así como AdSDV. -vp-P42, que contiene la unidad de expresión unida al promotor P42 completa en una construcción desactivada del promotor de poliedrina. La formación de partículas similares a virus (VLP) solo se observó en el cultivo transfectado con AdSDV-Bac-vpORF1. Las VLP se purificaron utilizando un gradiente escalonado de sacarosa, con acumulación de partículas en la fracción del 20% (Fig. 3a). La transfección con el bácmido AdSDV-Bac-vpORF3 produjo un efecto citopático rápido (CPE) dentro de los dos días posteriores a la transfección, a diferencia de los cinco a siete días en el caso de AdSDV-Bac-vp-ORF1. Usando DEAE-dextrano, AdSDV-Bac-vpORF3 también se transfectó a grillos domésticos comunes vivos, los cuales murieron dentro de los tres días posteriores a la inoculación, en lugar de no desarrollar ningún signo tras la transfección con AdSDV-Bac-vpORF1 en el plazo de 14 días. largo período de observación.

a gradientes de pasos de sacarosa visualizados bajo luz fluorescente, después de la ultracentrifugación. Las fracciones ocupadas por partículas purificadas similares al virus AdSDV (izquierda) o cápsides (derecha) están marcadas con pequeñas flechas blancas. b Purificación de las cápsidas de AdSDV directamente de los grillos domésticos fallecidos mediante un gradiente continuo de CsCl, que también se utilizó para evaluar la densidad flotante de cada población de cápsidas. Las flechas pequeñas marcan las fracciones de la cápsida de AdSDV. c SDS-PAGE en poliacrilamida al 15% de las fracciones purificadas en gradiente de sacarosa y CsCl obtenidas. EC significa cápsides vacías, FC marca cápsides completas llenas de genoma, las VLP de ORF1 se expresaron de forma recombinante a partir del gen de la proteína estructural vpORF1. d Mapa de cobertura de las lecturas de secuenciación de proteínas, obtenido mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía nanolíquida (Nano-LC/MS/MS) y previamente extirpado del gel de poliacrilamida en el panel C. Las regiones que se representaron entre las lecturas de MS están coloreadas en verde. e Gráficos de caja y bigotes que muestran la cuantificación del ADN viral de AdSDV en cada fracción de cápside purificada, mediante PCR en tiempo real (qPCR). Los números de copias del genoma obtenidos se presentan en una escala logarítmica de base 10. Los bigotes indican el rango de los puntos de datos, con los valores máximo y mínimo mostrados en los extremos. Las paredes de la caja indican el cuartil inferior y superior, respectivamente. La mediana está indicada por la línea del cuadro central. La media de cada serie se muestra con una X. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen para este panel. N = 3 experimentos cuasi independientes (las poblaciones de virus de las que se extrajo el ADN derivan de tres eventos de purificación del mismo lote de grillos domésticos comunes infectados con AdSDV). f Micrografías electrónicas de cada fracción de la cápsida de AdSDV.

Las cápsides se purificaron de los letárgicos grillos domésticos infectados con AdSDV. El gradiente de sacarosa posterior tenía dos bandas de partículas distintas; en la fracción del 20% (cápsides vacías, EC) y en la fracción del 25% (genoma que contiene cápsides "completas", FC) (Fig. 3a). Cuando se sometió a centrifugación isopícnica en un gradiente continuo de CsCl, la banda EC se separó en dos bandas, con una densidad flotante de 1,132 g/cm3 (EC1) y 1,191 g/cm3 (EC2), respectivamente, mientras que la banda FC única tuvo una densidad flotante. densidad de 1,459 g/cm3 (Fig. 3b).

El análisis mediante SDS-PAGE reveló una variación en la proporción de incorporación de bandas de proteínas en tamaños de ~ 55, 50, 43, 40 y 38 kDa (Fig. 3c) en las poblaciones de cápside. Las bandas se escindieron y analizaron mediante espectrometría de masas en tándem con cromatografía nanolíquida (Nano-LC/MS/MS), y las secuencias de proteínas se buscaron en la base de datos de proteínas no redundante del NCBI, así como en el genoma de AdSDV, revelando que todas las bandas comprendía únicamente productos de vpORF1 (Tabla S4). La banda SDS-PAGE de 43 kDa se correspondía con el peso previsto de vpORF1 y fue la única con cobertura en todo el ORF completo (Fig. 3d). En consecuencia, esta proteína fue designada VP1, el componente principal de las cápsides EC, EC1 y EC2 y ~50% de la población de FC. Todas las bandas menores mostraron el mismo perfil de cobertura, siendo versiones N-terminalmente truncadas de VP1. Designamos la proteína VP2 de 38 kDa, que representa una fracción minoritaria de las cápsides EC, EC1 y EC2, pero que representa la mitad de las VP que comprenden las partículas FC. VP2 también era el componente de las bandas menores de 55 y 50 kDa, cuyo tamaño excede la capacidad de codificación del genoma de AdSDV.

Las fracciones EC y FC variaron significativamente en el contenido del genoma, pero cada una contenía una proporción similar de segmentos ns y vp (Fig. 3e). Las micrografías de microscopía crioelectrónica (crio-EM) revelaron que el recuento sistemáticamente alto del genoma de la población de FC (en el rango de >1015 partículas genómicas de cada segmento) se debe de hecho a la presencia de partículas genómicas casi exclusivamente completas (Fig. 3f). Este número fue varios logs menor en el caso de las cápsides EC, que mostraban una proporción abrumadoramente grande de cápsides vacías. Las bandas EC1 y EC2 purificadas con CsCl estaban compuestas exclusivamente de partículas vacías (Fig. 3f). Para investigar más a fondo la ausencia de los productos de PLA2 que incluyen vpORF3, se realizó un ensayo colorimétrico de PLA2 con cada población de cápside y se demostró que ninguno de ellos mostraba actividad de PLA2, en concordancia con la ausencia de vpORF3 sugerida por el Nano-LC/MS/ EM (Figura S5). El modelado de homología de vpORF3 (Fig. 4a) y su derivado empalmado (Fig. 4b) por AlphaFold232 reveló que la proteína alberga un núcleo catalítico PLA2 altamente conservado, que muestra similitud estructural con las proteínas PLA2, como la proteína venenosa de 119 aa de largo. la cobra china (Naja atra) (Fig. 4c). Los modelos de homología de vpORF3, así como sus derivados empalmados, no mostraron parecido estructural con las proteínas de la cápside viral canónica.

Predicciones estructurales de la proteína vpORF3 (a) del densovirus segmentado de Acheta domesticus (AdSDV), así como del producto proteico de la transcripción 3 de vp, expresado uniendo vpORF2 N-terminalmente con vpORF3 (b). Las predicciones fueron creadas por la canalización AlphaFold2 proporcionada por ColabFold (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.08.15.456425v1). Los diagramas de cinta en ambos paneles están coloreados por los valores de pLDDT, lo que indica la confiabilidad de la predicción como se muestra en la leyenda. c Muestra el dominio de fosfolipasa A2 (PLA2) del modelo vpORF3 (azul) superpuesto con la estructura PLA2 del veneno de cobra china (Naja atra) (ID de PDB: 1POA) (naranja). Se muestran los átomos y enlaces de la cadena lateral Tyr del dominio YXGXG conservado del bucle de unión de calcio PLA2, así como las cadenas laterales del núcleo catalítico conservado (HD). El ion Ca2+, presente en la estructura PLA2 del veneno de cobra, está marcado por una esfera verde.

Las poblaciones de cápside de AdSDV y las VLP se sometieron a recopilación de datos mediante crio-EM seguida de reconstrucción de imágenes de una sola partícula (Tabla S6), obteniendo estructuras de cápside para las VLP de ORF1 a 3,3 Å (PDB ID: 8EU7), para la CE (PDB ID: 8ERK), cápsides EC1 (PDB ID: 8EU6) y EC2 (PDB ID: 8EU5) a 2,5 Å, 3 Å y 3,1 Å, respectivamente, así como para las cápsides FC a 2,3 Å (PDB ID: 8ER8) ( Figura 5a). Cada población poseía la simetría icosaédrica T = 1 esperada y un tamaño de partícula de 20 a 25 nm. La cápside de AdSDV mostró una superficie general "lisa" con la única área sobresaliente que rodea el eje de simetría quíntuple. El interior de los EC1 y EC2 carecía de densidad, salvo una pequeña cantidad de “polvo” en las proximidades del triple eje. La misma ubicación estaba ocupada por una mayor cantidad de densidad desordenada en las vpORF1-VLP. El interior del FC estaba lleno de densidad atribuida al genoma ssDNA. La ligera cantidad de densidad similar al genoma del interior de la cápside EC confirmó la cuantificación del genoma y los resultados de EM, es decir, que esta población es heterogénea y está compuesta por cápsides EC1, EC2 y FC (detalladas en la Fig. S7).

a Vistas de superficie (izquierda) y sección transversal (derecha) de los mapas de densidad electrónica de la cápside AdSDV y de las VLP vpORF1 obtenidos, representados en ơ = 1, con el ejemplo de densidad y modelo atómico mostrado al lado de cada mapa en ơ = 4. Los mapas están coloreados radialmente, orientados en la convención icosaédrica I1 (eje doble en el plano z). Los ejes de simetría cinco, tres y dos están marcados por un pentágono, un triángulo y una elipse, respectivamente. El genoma completo que contiene la fracción de la cápside se denomina FC, mientras que EC abrevia las diversas fracciones de la cápside vacía extraídas de los gradientes de sacarosa y CsCl isopícnico. b Diagrama de cinta que muestra el modelo atómico de una sola subunidad de la cápside completa (FC) de AdSDV. Los elementos estructuralmente conservados se muestran en negro y gris, los bucles que los conectan están resaltados en sus respectivos colores. Los ejes de simetría están etiquetados igual que en el panel A, para indicar la orientación. c Superposición de los diagramas de cinta del modelo atómico de subunidades, obtenidos de la población de cápside infecciosa (FC) llena de genoma, de la fracción de cápside vacía con mayor flotabilidad (EC1) y el vpORF1, VLP expresadas de forma recombinante.

La secuencia de vpORF1 podría modelarse en el mapa de densidad de FC desde Thr47 a Leu377, el residuo C-terminal final (Fig. 5b). La subunidad AdSDV VP mostró el pliegue canónico de gelatina de ocho hebras, complementado por una βA N-terminal, ubicada en una región N-terminal alargada. La disposición y el tamaño aproximado de cada bucle desde βA a βB hasta βH a βI es muy similar al de PstDV, respaldado por una puntuación DALI Z de 16,812. El monómero EC, EC1, EC2 y ORF1-VLP carecían de dos residuos ordenados N-terminalmente, así como de la cola C-terminal inusualmente alargada de la población FC, lo que convierte a Gln366 en el último residuo ordenado (Fig. 5c). Al superponer el modelo VP del monómero de todas las poblaciones de cápside, la única región que exhibe una diferencia conformacional significativa fue el bucle DE, que comprende el canal quíntuple y la pared (Fig. 5c). Los modelos de cápside VP integrados en la densidad EC1 y EC2, respectivamente, eran esencialmente idénticos (Fig. 6a).

a La estructura de los monómeros EC1 y EC2 es idéntica, excepto por regiones muy flexibles y mal modeladas. b Reconstrucción estructural de baja resolución de EC1 (izquierda) y EC2 (derecha), que muestra la sección transversal del canal quíntuple, con una resolución de 8,4 Å y 9,3 Å, respectivamente (ơ = 1). El estrechamiento del canal quíntuple de EC2 no se pudo observar en las estructuras crio-EM de alta resolución.

Aunque AdSDV muestra una morfología distinta dentro de Parvoviridae, la topología general de su superficie exterior se asemeja a la de la cápside de PstDV (Fig. 7a), superponible con una desviación cuadrática media (RMSD) de 2.8 Å (Fig. 7b). La morfología de la superficie de AdSDV es significativamente diferente de la de AdDV, y solo se pueden superponer sus núcleos de rollo de gelatina (Fig. 7b). La cápside de AdSDV alberga el volumen interior más pequeño de Parvoviridae (Fig. 8a), lo cual es muy evidente, dado que su cápside puede caber dentro del interior de la cápside de GmDV (Fig. 8b).

a Comparación de la superficie de la cápside de la cápside completa (FC) de AdSDV con la de otros miembros de la familia Parvoviridae, es decir, Penaeus stylirostris densovirus (PstDV), Penaeus monodon metallodensovirus (PmMDV), Acheta domesticus densovirus (AdDV), Bombyx mori densovirus que infectan invertebrados. (BmDV) y Galleria mellonella densovirus (GmDV), así como el parvovirus canino (CPV) que infecta a vertebrados y el virus adenoasociado 2 (AAV2). Cada mapa de modelo de superficie está orientado de la misma manera que en el panel A y está coloreado radialmente. b Superposición del diagrama de cinta del modelo atómico de la subunidad FC de AdSDV con los de otro grillo doméstico que infecta densovirus de la subfamilia Densovirinae (AdDV), así como con PstDV, su pariente más cercano para el cual se ha resuelto la estructura de la cápside de alta resolución, de la subfamilia Hamaparvovirinae. .

Una vista de sección transversal del canal quíntuple en el caso de las partículas similares al virus (VLP) vpORF1, tanto las poblaciones de cápside vacía (EC) como las partículas llenas de genoma (FC) completas. La densidad de electrones está coloreada radialmente desde el centro del mapa y se muestra como una mezcla en ơ = 2. Cada mapa está equipado con su modelo atómico correspondiente como diagramas de cinta, así como con el diagrama de cinta de la estructura FC. La flecha naranja indica el extremo N del FC. b Vista de arriba hacia abajo de la apertura del canal quíntuple, el poro quíntuple, con la densidad electrónica representada en ơ=2. El modelo atómico ajustado muestra el diagrama de cinta así como las cadenas laterales de los residuos correspondientes. Tenga en cuenta el cambio drástico de conformación de los cinco bucles DE al abrir el canal desde la conformación cerrada de las cápsides vacías (EC) frente a la conformación abierta de la población FC llena de genoma. Tenga en cuenta la diferencia entre el tapón hidrofóbico que cubre el canal en el caso de las VLP vpORF1, a diferencia de la externalización N-terminal real observada en las cápsides FC. c Diagramas de cinta del trímero AdSDV FC (panel izquierdo), que muestran la apertura del anillo β, típico de los densovirus. El panel central muestra las cadenas laterales hidrófobas y con carga positiva, resaltadas en cian, que ocupan el anillo, y el panel derecho muestra un ejemplo de la arquitectura de tres ejes de los parvovirus de Parvovirinae que infectan vertebrados, representados por el parvovirus canino. d Diagramas de cinta de la superficie interna del dímero AdSDV, interior en comparación con los otros tres tipos de estrategia de ensamblaje de dímeros, descritos en Parvoviridae hasta ahora. Los ejes de simetría están etiquetados por un pentágono (eje quíntuple), un triángulo (eje triple) y una elipse (eje doble). El extremo N de cada subunidad está marcado por la flecha verde. Tenga en cuenta las diferencias entre los parvovirus que infectan a los vertebrados, representados aquí por el parvovirus canino (CPV), en comparación con la conformación de intercambio de dominio de los miembros de la familia que infectan a los invertebrados, representados por Galleria mellonella densovirus (GmDV) y Penaeus monodon metallodensovirus (PmMDV). .

El canal quíntuple de AdSDV mostró dos estados de conformación distintos, es decir, "vacío" para las fracciones EC y vpORF1-VLP, o "lleno" como se observa en la población FC (Fig. 9a). En el estado lleno, los dos residuos ordenados adicionales conectan la columna de densidad con la capa FC, infiriendo que la densidad es parte de la región N-terminal desordenada de 46 aa de largo. Mientras que el canal de vpORF1-VLP está cubierto por un tapón hidrofóbico, una densidad pequeña y difusa ocupa el canal en las poblaciones EC1 y 2. En un mapa de baja resolución de 10 Å, se revela que el canal EC2 es significativamente más estrecho que su contraparte EC1 (Fig. S6B). Para acomodar la columna de densidad, el pico del bucle FC DE se aleja tangencialmente del canal, que está ocupado por grandes cadenas laterales aromáticas e hidrofóbicas, como Tyr159 e Ile152 (Fig. 9b). Por el contrario, ambas poblaciones de EC mostraron bucles DE apuntando hacia adentro, estrechando el poro de 16,0 Å (FC) a 10,1 Å, con Tyr159 e Ile152 retraídos debajo del pico del bucle DE. Las vpORF1-VLP poseen una conformación similar a la de las cápsides FC (Fig. 9b).

a Comparación de las métricas de la cápside y el genoma de varios miembros de Parvoviridae con las de (AdSDV). Las subfamilias, incluidas Parvovirinae, Densovirinae y Hamaparvovirinae, respectivamente, están separadas por líneas gruesas. Abreviaturas: parvovirus canino CPV, virus adenoasociado 2 AAV, densovirus Galleria mellonella GmDV, densovirus Acheta domesticus AdDV, densovirus 1 Bombyx mori BmDV1, densovirus PstDV Penaeus stylirostris, metalodensovirus PmMDV Penaeus stylirostris. El volumen interno de BmDV1 probablemente esté sobreestimado ya que los residuos de VP3 fueron parcialmente rastreables (372 de 454 residuos) en la densidad electrónica promediada icosaédricamente (excepto 42 residuos N-terminales y 40 C-terminales). b Comparación directa del tamaño de la cápside de AdSDV con el de la cápside de parvoviral más grande hasta el momento, cuya estructura atómica está resuelta, GmDV. Ambos modelos de cápside completa se muestran como diagramas de cinta y aquí se muestra la vista de la sección transversal central.

La cápside de AdSDV alberga un segundo poro en su eje triple, que tiene 10,8 Å de ancho y está creado por tres hebras β entrelazadas, que forman un anillo β (Fig. 9c), revestido por grandes cadenas laterales hidrofóbicas, que cubren un anillo de tres histidinas. (Su232).

El largo segmento N-terminal βA de las subunidades de la cápsida de AdSDV está en una conformación de intercambio de dominio en el doble eje de simetría, con su βA interactuando con el βG de su subunidad doble vecina, que comprende la superficie interior de láminas β de cinco cadenas. en orden BIDGA (Fig. 9d).

La porción C-terminal alargada de las proteínas AdSDV-FC ingresa al interior de la cápside desde el triple eje de simetría, conectándose a la superficie interna a lo largo de la doble interfaz. Cada subunidad interactúa con la cola C-terminal del vecino quíntuple de su subunidad vecina doble (Fig. 10a). Esta interacción está ausente en todas las demás poblaciones de cápside, lo que da como resultado que el último residuo C-terminal ordenado ingrese al interior directamente debajo del eje de simetría triple, donde el extremo C-terminal que cuelga libremente se manifiesta como varias cantidades de densidad desordenada (Fig. 10b , figura 5a). La densidad ordenada de seis nucleótidos por cada subunidad FC ocupa el doble eje interior. Cinco de ellos están interconectados e interactúan directamente con la superficie de la cápside a través de interacciones de apilamiento π (Fig. 10c). La primera pila (pila 1) también incorpora el sexto nucleótido de purina independiente. El ssDNA ordenado muestra la secuencia purina-purina-pirimidina-purina-purina, un motivo rico en GC, que es especialmente abundante en los extremos de AdSDV, así como en varios intervalos a lo largo de toda la secuencia de ambos segmentos (85 veces para el NS segmento, 75 veces para el segmento VP). La densidad del genoma mostró una cantidad cada vez mayor de orden cuando está muy cerca de la superficie interior, como resultado de que las colas C-terminales "agarran" y "pegan" el genoma al doble eje interior, estableciendo pilas π a través de los motivos pentanucleares ricos en GC (Fig. 10d).

a Vista interior del doble eje de AdSDV, con la representación de la densidad electrónica dividida en zonas para las seis bases de ácido nucleico ordenadas (ơ = 3), solo presente en el caso de las cápsides completas (FC) llenas de genoma. La representación del diagrama de cinta del modelo atómico de la cadena A se muestra en azul y su doble subunidad vecina en negro. La subunidad quíntuple vecina de la cadena A se presenta en verde, mientras que la subunidad quíntuple vecina de su subunidad doble vecina se presenta en amarillo. El modelo atómico del ácido nucleico se muestra en cian. b Vista en sección transversal lateral del anillo β, que ocupa el triple eje de AdSDV. El triple eje real está marcado con una flecha. La densidad electrónica se muestra dividida en zonas para los residuos ordenados en el extremo C final, lo que indica que la porción ordenada del extremo C del FC se extiende mucho y se dobla debajo del doble eje de simetría. En ausencia de un genoma empaquetado, la región ordenada termina directamente debajo del triple eje. c El genoma AdSDV interactúa con la superficie interior a través de interacciones de apilamiento π, debajo del doble eje de simetría. Observe cómo estas pilas son el resultado de interacciones entre dos regiones de ssDNA y cuatro subunidades, coloreadas del mismo modo que en a. d Sección transversal del mapa AdSDV FC, con la densidad mostrada como una mezcla en ơ=1,5. Cuanto más cerca se encuentra la densidad interior del genoma del doble eje de simetría, más ordenada parece. La flecha cian apunta a la ubicación de los nucleótidos ordenados bajo el doble eje de simetría. e Perfil de temperatura de fusión de las cápsides de AdSDV y VLP en los cuatro pH que los parvovirus pueden encontrar durante el tráfico endolisosomal, realizado por duplicado. Tenga en cuenta la diferencia en la termoestabilidad entre las partículas vacías y las VLP (EC1, EC2, EC, vpORF1-VLP) frente a la población de FC que contiene genoma. Se muestran los resultados de n = 2 ejecuciones independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen para este panel.

El empaquetamiento del genoma también alteró la termoestabilidad de la cápside de AdSDV, caracterizada por fluorometría de barrido diferencial (DSF) (Fig. 9e, perfiles de curva de fusión mostrados en la Fig. S8). A pH neutro, las cápsides FC ya poseían una temperatura de despliegue de 2 a 4 °C más alta en comparación con las otras poblaciones. Esto aumenta a 5-6 °C a pH 6,0, simulando el entorno del endosoma temprano, y a 6-8 °C a pH 5,5, modelando el entorno del endosoma tardío. A un pH lisosomal de 4,0, la diferencia sigue siendo de 3 a 4 °C. Independientemente del contenido del genoma, cada población de cápside de AdSDV mostró una estabilidad máxima a pH 5,5, que disminuyó significativamente al pH 4,0 de los lisosomas maduros.

Tal como se define actualmente, todos los miembros de Parvoviridae poseen un genoma monopartito de ADN monopartito, como una de las características clave de la familia10. A pesar de su genoma bipartito, AdSDV muestra todas las demás características necesarias para la clasificación dentro de Parvoviridae (ver Introducción). Sin embargo, sus distintos casetes NS y VP están ubicados de manera única en dos segmentos separados del genoma.

La segmentación del genoma es rara entre los virus de ADN de huéspedes animales, a diferencia de los virus de ADN multipartitos de hongos y plantas, que empaquetan cada segmento de ADN en una partícula viral separada33. Experimentos de Ojosnegros et al.34. sugirieron para los virus ssRNA+ que la segmentación del genoma permite maximizar el contenido genético al tiempo que se preserva la estabilidad de la cápside y la densidad del genoma energéticamente favorable. La inferencia de filogenia mostró que AdSDV es miembro del género Hamaparvovirinae, Brevihamaparvovirus. Los géneros Brevi- y Penstylhamaparvovirus albergan los genomas más pequeños dentro de Parvoviridae, que están empaquetados en partículas igualmente pequeñas23. El volumen interior de la cápside de AdSDV es ~50% del de GmDV, pero su densidad de flotación es similar (1,44 frente a 1,45 g/cm3)20. Como la longitud unida de sus dos segmentos sería sólo ligeramente mayor, pero aumentaría significativamente la densidad de partículas, es razonable suponer que AdSDV también es un virus multipartito y multicompartimental. Otra familia de virus ssDNA lineal que infecta artrópodos, los Bidnaviridae, también alberga un genoma bipartito, con genes derivados de cuatro linajes virales distintos35. Los bidnavirus, sin embargo, a pesar de codificar proteínas de la cápside similares a PV, utilizan una estrategia de replicación distinta al codificar un gen de ADN polimerasa dependiente de ADN en sus genomas e inician la replicación mediante cebado de proteínas36. El genoma de AdSDV es el primero en mostrar recombinación entre subfamilias dentro de Parvoviridae, al incorporar el vpORF3 originado en Densovirinae en su genoma ancestral hamaparvoviral. La adquisición de ORF distantes para aumentar la aptitud viral puede conducir a una eventual segmentación del genoma y una estrategia de replicación multipartita en virus de ADN ss lineales para mantener la estabilidad de las partículas y la densidad óptima del genoma.

Hasta la fecha, todos los dominios PLA2 parvovirales están ubicados dentro de genes que codifican proteínas estructurales u obtienen la región VP C-terminal común mediante corte y empalme alternativo, de modo que puedan ensamblarse en la cubierta de la cápside12,28,37. En ambos casos, el dominio PLA2 se encuentra aguas arriba de la región principal de codificación de VP. vpORF3, de origen Scindoambidensovirus, no solo se coloca aguas abajo del vpORF1 principal, sino que también se incluye en una unidad de transcripción separada. En consecuencia, AdSDV podría ser un parvovirus único en expresar un PLA2 no estructural. Las PLA2 secretadas y citosólicas existen en una amplia gama de organismos y están asociadas con la lisis celular38 y desempeñan un papel en el inicio de la apoptosis39. Esto puede implicar que vpORF3, con un núcleo catalítico conservado y un bucle de unión de Ca2+, podría contribuir potencialmente a la salida celular y la propagación de AdSDV, especialmente cuando se considera la toxicidad del VP-ORF3 expresado individualmente. Esto plantea la cuestión de si este dominio en los parvovirus con una PLA2 estructural también tiene una doble función.

Las estrategias de transcripción parvoviral varían significativamente incluso dentro de cada subfamilia, y los PV que infectan a los vertebrados y los DV ambisentidos dependen en gran medida del empalme alternativo3,10. Los Brevihamaparvovirus, sin embargo, muestran un perfil de transcripción más simple y se basan exclusivamente en escaneos con fugas40. AdSDV, por el contrario, alberga una estrategia de transcripción compleja que emplea empalme alternativo. Los miembros ambisense de Densovirinae también poseen un mayor número de proteínas NS, a veces hasta cuatro3,41. Tanto los genomas ambisense como multipartitos pueden superar las limitaciones del típico orden de expresión del promotor monosentido temporal parvoviral al permitir potencialmente que la maquinaria de transcripción acceda simultáneamente a los casetes de expresión de VP y NS. Por lo tanto, la gran cantidad de proteínas NS de AdSDV podría ser una adaptación a la estrategia de replicación multipartita, lo que sugiere una flexibilidad extrema en la evolución de la expresión parvoviral, maximizando la capacidad de codificación del genoma pequeño.

La morfología de la superficie y el tamaño de la cápside de AdSDV, a diferencia de su perfil de transcripción, recuerdan a PstDV, un hamaparvovirus. Sin embargo, la cápside de AdSDV muestra interacciones multiméricas a diferencia de otros PV. Los extremos N de las VP de DV están dispuestos en una conformación de dominio intercambiado, donde la βA interactúa con la βB de la subunidad doble vecina y no con su propia βB, como en el caso de Parvovirinae20,21,22,23. En ambos casos, sin embargo, la superficie interior de la cápside está compuesta por láminas ABIDG de cinco hebras12. El dímero AdSDV representa un tercer tipo de arquitectura interior, que también se basa en láminas β de cinco hebras, pero en su lugar con conformación BIDGA.

El triple eje del DV está cubierto por el anillo β, que crea una abertura en la superficie de la cápside de varios tamaños, de manera similar a la familia de virus T = 3 ssRNA, Tombusviridae42 en lugar de Parvovirinae, donde esta área está cubierta por púas y protuberancias12. Anteriormente se sugirió que esta abertura era la ubicación del empaquetado del genoma DV, en la cápside de GmDV20. El anillo de AdSDV también está revestido por grandes cadenas laterales hidrófobas, así como por residuos voluminosos y cargados positivamente, a diferencia de la abundante carga negativa de la entrada de cinco poros, la ubicación canónica de la entrada y el descubrimiento del ADN12. Además, la porción alargada de 12 aa de largo de los extremos C también se encuentra aquí, en ausencia de un genoma empaquetado. Esta región no participa en la composición de la cubierta de AdSDV, pero interactúa directamente tanto con la superficie interior como con el genoma. Estas características sugieren un modelo de empaquetado del genoma relacionado con tres ejes, en lugar de uno que involucra cinco ejes.

Se sabe poco sobre cómo interactúa el genoma con el interior del fotovoltaico. Los protoparvovirus albergan grandes porciones de ADNss ordenado icosaédrico, dispuestos en pilas π, mientras que los virus adenoasociados y AdDV muestran solo un par de nucleótidos ordenados en el triple eje16,21,43,44,45,46,47. Sin embargo, las interacciones entre el interior y estos nucleótidos son escasas y limitadas a posibles enlaces de hidrógeno. La estructura de AdSDV FC mostró la mayor cantidad de nucleótidos ordenados hasta el momento, que interactúan directamente con la superficie interior de la cápside. Esta interacción entre el interior del genoma, que involucra cuatro subunidades junto con dos regiones separadas del genoma ssDNA, proporciona estabilidad adicional a las interacciones que de otro modo serían débiles en el doble eje. Este mecanismo puede ser responsable del aumento de la termoestabilidad de la población de FC. Independientemente del contenido del genoma, las cápsides de AdSDV muestran un perfil de termoestabilidad ligado al pH idéntico al de PLA2, incluidos los miembros de Parvovirinae, lo que sugiere una vía de tráfico endolisosomal similar, incluso en ausencia de un dominio PLA2 unido a la cápside16,25,27 ,48.

La densidad de electrones que ocupa el quíntuple canal parvoviral se ha asociado consistentemente con la externalización N-terminal, luego de la exposición a un pH endosómico bajo o como resultado del empaquetamiento del genoma25,43,49. El AdSDV es el primer parvovirus, donde la “columna de densidad”, que ocupa el canal quíntuple de la fracción FC, alberga una conexión directa con el extremo N ordenado, lo que confirma que la externalización del extremo N es un mecanismo conservado e independiente de la presencia de un PLA2 funcional.

La FC que empaqueta el genoma, a diferencia de las poblaciones de la CE, comprendía una proporción de VP1 a VP2 de 1:1. Es posible que algunos de los extremos N de VP externalizados sufran escisión proteolítica, lo que explicaría el cambio en la proporción de incorporación de VP. Este mecanismo, siempre que exista, podría haber evolucionado para garantizar que sólo los viriones maduros alcancen el sitio de replicación final, ya que varias familias de virus requieren proproteínas convertasas celulares para madurar50. A diferencia de las cápsides maduras de la población FC, las EC se segregaron en dos poblaciones de densidad boyante. Como la estructura de las fracciones EC1 y EC2 solo difiere en la conformación del canal quíntuple, estas poblaciones pueden diferir en las etapas de maduración de las partículas. Alternativamente, las cápsidas EC2 podrían quelar iones, que no se pueden promediar icosaédricamente, de manera similar a la cápsida GmDV20. Aunque las vpORF1-VLP carecen de un genoma empaquetado, su poro quíntuple muestra la conformación abierta de las partículas FC. Esto sugiere que los cambios de conformación que conducen a la apertura del poro quíntuple podrían ocurrir incluso antes de la externalización del extremo N inducida por el empaque.

En conjunto, AdSDV proporciona la primera evidencia de una estrategia de replicación multipartita dentro de Parvoviridae, como consecuencia de mantener un tamaño y morfología de cápside similar a Brevihamaparvovirus y al mismo tiempo aprovechar la ganancia de aptitud de un ORF recombinante de otra subfamilia. Las adaptaciones impuestas por la estrategia de replicación multipartita de AdSDV pueden manifestarse en su perfil de expresión, requiriendo un mayor número de proteínas NS, lo que podría haber llevado a la incorporación de splicing alternativo. AdSDV también demuestra un mecanismo único de empaquetamiento de ADN, que podría involucrar el triple anillo para la entrada del genoma, después del cual el genoma se une al doble eje interior mediante los extremos C de VP. Cuando se completa el empaquetamiento, los VP N-termini se exteriorizan a través de un canal quíntuple posiblemente ya abierto, lo que los somete a escisión proteolítica en algún momento de su ciclo de vida. Estos hallazgos alteran las perspectivas de los rasgos parvovirales que antes se consideraban conservadores, incluido un genoma monopartito, un dominio PLA2 asociado a la cápside, las interacciones entre la cápside y el ADN del parvovirus y la arquitectura interior del DV.

Los grillos domésticos comunes fallecidos (~ 100 individuos de género mixto) de las instalaciones de cría se homogeneizaron mecánicamente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH 7,4). El homogeneizado se aclaró mediante centrifugación a baja velocidad y el sobrenadante diluido en PBS se aplicó sobre una rejilla de Cu cubierta de carbono descargada luminiscente (Electron Microscopy Sciences) y se tiñó con acetato de uranilo al 2%. Las rejillas secas se visualizaron con un voltaje de aceleración de 120 kV.

A partir de esta muestra, las partículas de virus se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio (419,5 mg/ml) para obtener ADN viral para la clonación. Mediante extracción con cloroformo/butanol (volumen 1:1), seguida de centrifugación a baja velocidad, se obtuvo un sobrenadante transparente que contenía partículas virales. El stock de virus se concentró a partir del sobrenadante mediante ultracentrifugación a 40.000 rpm en un rotor tipo 60Ti durante 2 h a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en un pequeño volumen de PBS y se verificaron nuevamente mediante tinción negativa EM para verificar la presencia de partículas. Este stock de virus se aplicó a alimento seco para grillos en una concentración de proteína de 0,1 mg/ml. Usando una jeringa de insulina de 1 ml y una aguja delicada, se inyectaron ~5 µl en grillos domésticos de ~10 mm de largo, apuntando a los cuerpos grasos dentro del abdomen pero evitando la punción de los órganos abdominales.

El ADN viral se extrajo con el kit de ácido nucleico viral de alta pureza (Roche) y se eluyó en 40 μM (μL) de agua destilada. El ADN extraído se sometió a amplificación mediante ADN polimerasa Phi29 (New England Biolabs). El ADN aislado tenía extremos romos utilizando ADN polimerasa T4 y un fragmento grande Klenow de ADN polimerasa I (New England Biolabs) en presencia de 33 µM de cada dNTP y se clonó en el sitio de restricción EcoRV de un vector pBluescript KS+ y se secuenció mediante recorrido con cebador. . Se clonó la secuencia completa de ambos segmentos, pero sin los extremos intactos. Para obtener las secuencias de los extremos, se unieron adaptadores monocatenarios (5'-Phos-ATCCACAACAACTCTCCTCCTC-3') a los segmentos del genoma de AdSDV utilizando T4 RNA ligasa I (New England Biolabs). Utilizando el cebador adaptador inverso emparejado con otro cebador, dirigido al genoma AdSDV cerca de los extremos, se realizó la amplificación por PCR. La reacción de amplificación de 25 µl utilizó polimerasa de alta fidelidad Phusion® (New England Biolabs), complementada con 10 % de dimetilsulfóxido y 3 µl de EDTA 2 mM. Los amplicones obtenidos se clonaron de forma roma en un plásmido pBluscript KS+ digerido con EcoRV y se transformaron en la cepa Sure Escherichia coli (Stratagene), cultivada a 30 °C.

Para construir ADN de bácmido recombinante, las regiones VP a expresar se amplificaron por PCR utilizando polimerasa de alta fidelidad Phusion® (New England Biolabs). Los cebadores incluyeron las secuencias de los sitios RE para utilizar el sitio de clonación múltiple pFastBac1. Obtuvimos un vector pFastBac Dual inactivado con poliedrina y P10 sometiéndolo a digestión de restricción en los sitios XhoI y BamHI, que flanquean los dos promotores. Los clones pFastBac1 o Dual knock-out obtenidos se verificaron mediante secuenciación Sanger y el inserto se transfirió a bacterias competentes DH10Bac (Thermo Fisher Scientific) mediante transposición. Se aisló el genoma del baculovirus recombinante, es decir, bácmido, de las colonias obtenidas y se verificó la presencia del inserto mediante PCR.

Se utilizaron juveniles sin alas de grillo doméstico común (Acheta domesticus), de 10 a 15 mm de longitud, de género mixto. Se sometieron a 100 personas a los estudios de inoculación iniciales para establecer que el AdSDV puede ser absorbido por alimentos contaminados. Infectamos a 500 personas mediante inyecciones directas de grasa corporal para investigar la patogénesis viral y para purificar las partículas de AdSDV. 50 personas participaron en inyecciones directas de grasa corporal con AdSDV-Bac-vp-ORF1 o AdSDV-Bac-vp-ORF3, respectivamente. La transfección con estos plásmidos se llevó a cabo mediante 2 mg/ml de DEAE-dextrano a 1 µg de ADN de bácmido.

Sf9 (ATCC CRL-1711) se obtuvieron directamente de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Los cultivos en suspensión se mantuvieron en medio SF900 II (Gibco) en un sistema sin suero a 28 °C. Se utilizó el reactivo Cellfectin II (Invitrogen) para la transfección de ADN a una densidad celular de 8 × 105 por pocillo. El medio de cultivo se aspiró y se reemplazó por medio de siembra de medio de insectos completo de Grace suplementado con 5% de FBS (Gibco) y medio de insectos no suplementado de Graces, mezclados en una proporción de 1:6, respectivamente. Después de agregar la mezcla de ADN y reactivo de transfección a los pocillos, las células se incubaron durante 5 h. El medio de transfección aspirado se reemplazó con medio SF900 II. Las células se revisaron diariamente para detectar signos de CPE y se recogió todo el cultivo cuando el 70% de las células se desprendieron de la placa o mostraron granulación. A esto le siguieron tres ciclos de congelación y descongelación en hielo seco y se transfirieron 200 μl de este stock del paso 1 (P1) a 25 ml de cultivo celular fresco suspendido Sf9 en matraces Erlenmeyer de policarbonato (Corning) a una densidad de 2,5 x 106 células. /ml, para crear el stock P2.

Se recolectaron grillos domésticos purificados inyectados con AdSDV tres días después de la inoculación y se extrajo el ARN total utilizando el kit Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research), donde el paso de desnaturalización se ejecutó agregando reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific). El ARN se trató mediante digestión con el kit TURBO DNA-free (Ambion) para eliminar la contaminación residual del ADN, y también se sometió a una PCR de control para los fragmentos de ADN restantes. La transcripción inversa se realizó solo en preparaciones completamente negativas para ADN utilizando las enzimas SuperScript IV o SuperScript III (Thermo Fisher Scientific), complementadas con no nombres aleatorios (Sigma-Aldrich). Para evitar una falsa detección de empalme, el ARN aislado se sometió a desfosforilación añadiendo fosfatasa antártica (New England Biolabs) y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Los cebadores se diseñaron en las siguientes posiciones nt del segmento NS de AdSDV: 594 (hacia adelante), 750 (hacia atrás), 941 (hacia atrás), 1269 (hacia adelante), 1358 (hacia atrás), 2202 (hacia adelante y hacia atrás), 2313 (hacia adelante) , 2538 (reverso). Los cebadores dirigidos al ARNm del segmento VP se colocaron en las siguientes ubicaciones nt: 614 (inverso), 560 (adelante), 1249 (adelante), 1614 (adelante y reverso), 1800 (adelante y reverso), 1971 (reverso), 2611 (avance y retroceso). Estos cebadores se utilizaron para amplificar regiones específicas del ADNc mediante PCR.

Se utilizaron cebadores oligo(dT) anclados con los cebadores directos 2202 y 2313 para el segmento NS, y los cebadores directos 1249 y 2611 en el caso del segmento VP para 3' RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Para realizar 5 'RACE para mapear los sitios de inicio de la transcripción, diseñamos adaptadores con la secuencia de 5'—GCUGAUGGCGAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA—3'. El ARN se sometió a desfosforilación mediante fosfatasa alcalina intestinal de ternera (New England Biolabs), seguido de extracción con fenol-cloroformo del ARN desfosforilado. Utilizamos pirofosfatasa ácida del tabaco (Ambion) para eliminar las tapas de ARN 5 '. Después de la ligación de adaptadores usando T4 RNA ligasa 1 (New England Biolabs), se ejecutó la transcripción inversa. La PCR se realizó con los cebadores readaptadores junto con los oligos 750 y 941 inversos en el caso del segmento NS y 614, 1614 y 1971 inversos para el segmento VP. Para saber qué señal de poliadenilación pertenece a qué promotor, se utilizó el mismo cebador readaptador con oligos de 20 nt de longitud, de los cuales 15 nucleótidos correspondían a los situados directamente aguas arriba de la cola poliA, incluyendo también una secuencia poliT de 5 nt de longitud. . Todas las PCR se realizaron utilizando Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (New England Biolabs) en un volumen de reacción final de 25 μL, incluidos 2 μL de diana de ADNc purificado, 0,5 μL de ambos cebadores en una concentración de 50 pmol, 0,5 μL de mezcla de dNTP con 8 μmol de cada nucleótido, 0,75 μL de solución de MgCl2 50 mM y 0,25 μL de enzima. Las reacciones de PCR se ejecutaron bajo un programa de 5 min de desnaturalización a 95 °C seguido de 35 ciclos de 30 s de desnaturalización a 95 °C, 30 s de hibridación a 48 °C y 1 o 2 min de elongación a 72 °C. El paso de elongación final duró 8 minutos a 72 °C. En el caso de las reacciones 5'RACE, se usaron 0,5 µL de enzima y el número de ciclos se redujo a 25. Para las reacciones 3'RACE, la reacción se complementó con 1 µL de MgCl2 50 mM y se omitió el paso de hibridación.

El ARNm total también se purificó a partir de cultivos de células Sf9 transfectadas por las construcciones de bácmidos AdSDV-Bac-VP-ORF1, AdSDV-Bac-VP-ORF3 y AdSDV-VP-P42, respectivamente. El ARNm purificado se transcribió de forma inversa y se sometió a amplificación por PCR, de modo que se pudo verificar la expresión del ARNm de estas construcciones, incluso en ausencia de VLP.

Las reservas de baculovirus AdSDV-Bac-VP-ORF1 P2 se incubaron durante al menos cinco días y se controlaron para detectar CPE todos los días. Cuando al menos el 70% de las células mostraron signos de CPE, se recogió el cultivo, se centrifugó a 3000 × g durante 15 minutos y las células sedimentadas se rompieron mediante tres ciclos de congelación y descongelación en hielo seco. Este sedimento celular lisado se resuspendió luego en 1 ml de 1x TNTM pH8 (Tris 50 mM pH8, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,2 %, MgCl2 2 mM) y se centrifugó nuevamente. El sobrenadante se volvió a mezclar con el sobrenadante del cultivo celular y se sometió a tratamiento con 250 unidades de Benzonase Nuclease (Sigma-Aldrich) por cada 10 ml. El líquido se mezcló con 1x TNET pH8 (Tris 50 mM pH8, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,2%, EDTA 1 mM) en una proporción de 1:1 y se concentró sobre un cojín de sacarosa al 20% en TNET, usando un Rotor tipo 60 Ti durante 3 h a 4 °C a 203.347 xg en una ultracentrífuga Beckman Coulter clase S. El sedimento se resuspendió en 1 ml de 1 x TNTM pH 8 y, después de una incubación durante la noche, se purificó en un gradiente escalonado de sacarosa del 5 al 40 % durante 3 h a 4 °C a 209.490 xg en el mismo instrumento en un rotor de ultracentrífuga preparativa de cubo oscilante SW 41 Ti. . Luego se recogió la banda única visible mediante punción con aguja y una jeringa de 10 ml de volumen. Para purificar el virus infeccioso, los grillos inoculados con AdSDV se homogeneizaron mecánicamente en 1x PBS y luego se sometieron a los mismos ciclos de congelación y descongelación y pasos de eliminación del lisado. Después del tratamiento con benzonasa, el lisado aclarado se sometió a los mismos pasos de purificación, detallados anteriormente. Para establecer la densidad de flotación de las cápsides de AdSDV, el sedimento suspendido con 1xTNTM de la etapa de cojín de sacarosa se mezcló en una solución 1xTNTM, en la que previamente se disolvió CsCl a una concentración de 419,5 mg/ml. Luego, la suspensión de CsCl se centrifugó durante 24 h en un rotor de ultracentrífuga preparativa de cubeta oscilante SW 41 Ti a 10 °C a 35000 rpm. La densidad de flotación de las fracciones obtenidas se estableció utilizando un refractómetro. Las fracciones aspiradas se dializaron en PBS 1X a pH 7,4 para eliminar la sacarosa o el cloruro de cesio.

La cuantificación de los segmentos VP y NS se realizó mediante amplificación por PCR en tiempo real (qPCR), utilizando un instrumento Bio-Rad CFX96. Se amplificó una secuencia diana de 300 pb de largo de ambos segmentos (posiciones nt 885 a 1188 para NS y 738 a 1035 para VP). Para la cuantificación del dsDNA se utilizó el Bio-Rad SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, con un programa de amplificación de desnaturalización de 5 min a 95 °C seguido de 45 ciclos de 30 s de desnaturalización a 95 °C, 15 s de hibridación a 55 °C y 30 s de elongación a 72 °C. Los resultados fueron analizados por el software CFX Maestro (Bio-Rad).

Las poblaciones de cápsida a una concentración de 0,1 mg/ml se dializaron en 1x tampón universal (Hepes 20 mM, MES 20 mM, acetato de sodio 20 mM, NaCl 0,15 M, CaCl2 3,7 mM) a pH 7,4, 6,0, 5,5 y 4,0. Se complementaron 22,5 µl de suspensión de cápside con 2,5 µl de tinte naranja SYPRO al 1% (Invitrogen) y se sometieron a DSF en un instrumento de qPCR Bio-Rad CFX96. De 30 °C a 99 °C, la muestra se cribó a una velocidad de rampa de 1 °C/min en pasos de 0,5 °C. La fluorescencia se midió en función de la temperatura, se representó como -dRFU/dT frente a la temperatura, que se multiplicó por -1 y se normalizó al valor más alto de RFU. Cada ejecución se realizó por triplicado.

Para el ensayo PLA2, se utilizó la misma concentración de cápside en tampón universal 1x, utilizando VLP de parvovirus B19 como control positivo, un generoso obsequio de Renuk Lakshmanan (Universidad de Florida). Como calentar la cápside de AdDV a 65 °C aumenta drásticamente la actividad de PLA221, cada población de cápside de AdSDV se sometió a este tratamiento durante 10 minutos. Realizamos el ensayo utilizando el kit de ensayo colorimétrico PLA2 de Cayman. El ensayo se realizó por triplicado a 28 °C durante 1 h y la absorbancia se midió a 414 nm.

Las bandas de gel extirpadas se digirieron con tripsina de calidad para secuenciación (Promega) y se deshidrataron con acetonitrilo 1:1 v/v: bicarbonato de amonio 50 mM, seguido de rehidratación con solución de ditiotreitol (DTT) (25 mM en bicarbonato de amonio 100 mM) y la adición de yodoacetamida 55 mM en solución de bicarbonato de amonio 100 mM. La proteasa se introdujo en los trozos de gel rehidratándolos en 12 ng/ml de tripsina en tensioactivo ProteaseMAX al 0,01 % durante 5 minutos. Luego, las bandas se cubrieron con 40 µl de tensioactivo ProteaseMAX al 0,01 %: bicarbonato de amonio 50 mM y se mezclaron suavemente en un agitador durante 1 h. La digestión se detuvo con la adición de TFA al 0,5%.

Nano-LC/MS/MS se realizó en un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive HF Orbitrap equipado con una fuente de nanospray EASY Spray (Thermo Scientific) operado en modo de iones positivos. El sistema LC fue un sistema UltiMate™ 3000 RSLCnano de Thermo Scientific. La fase móvil A era agua que contenía 0,1% de ácido fórmico y la fase móvil B era acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico. La fase móvil A para la bomba de carga era agua que contenía 0,1 % de ácido trifluoracético. Se inyectaron cinco microlitros de la muestra en una columna de captura µPAC C18 de PharmaFluidics a un caudal de 10 µl/ml. Esto se mantuvo durante 3 minutos y se lavó con B al 1% para desalar y concentrar los péptidos. Se utilizó µPAC de 50 cm de PharmaFluidics para separaciones cromatográficas con la temperatura de la columna a 40 oC. Se utilizó un caudal de 750 nl/min durante los primeros 15 minutos y luego el flujo se redujo a 300 nl/min. Los péptidos se eluyeron directamente de la columna al sistema Q Exactive usando un gradiente de 1 a 20 % de B durante 100 min y luego a 45 % de B en 20 min para un tiempo total de ejecución de 150 min. La secuencia de escaneo del espectrómetro de masas se basó en el método TopTen™ original; el análisis se programó para un escaneo completo registrado entre 375 y 1575 Da con una resolución de 60 000 y un escaneo MS/MS con una resolución de 15 000 para generar espectros de iones de producto para determinar la secuencia de aminoácidos en escaneos consecutivos del instrumento de los quince picos más abundantes del espectro. . Los iones con carga única se excluyeron de MS2. Se utilizó un pico de fondo de siloxano de 445,12003 como masa de bloqueo interno. Todas las muestras de MS/MS se analizaron utilizando Proteome Discoverer 2.4 (Thermo Fisher Scientific).

La secuencia completa de ambos segmentos de AdSDV se ensambló utilizando el paquete Staden v2.0.0 y v4.11.251. El genoma ensamblado fue anotado, así como las transcripciones ensambladas e investigadas en Artemis Genome Browser por el Instituto Sanger52. Para investigar dominios conservados con homólogos conocidos en las secuencias de aa derivadas se utilizó la aplicación web SMART53. La similitud estructural de las estructuras de la cápside resueltas con las disponibles en el banco de datos de proteínas RCSB (PDB) se investigó utilizando el servidor DALI54.

Para la inferencia de filogenia, se construyeron alineamientos, incorporando los resultados de alineadores estructurales, múltiples y por pares, utilizando el algoritmo Expresso de T-Coffee, ejecutado en modo PDB55. La alineación construida se editó utilizando Unipro Ugene56. La selección del modelo se ejecutó mediante ProtTest v2.4, sugiriendo el modelo de sustitución LG + I + G + F basado en los criterios de información bayesianos y de Akaike57. La inferencia bayesiana fue ejecutada por el paquete BEAST v1.10.4, utilizando un reloj relajado logarítmico normal con una especiación de Yule anterior, a lo largo de 50.000.000 de generaciones58. Los diagnósticos de convergencia se llevaron a cabo utilizando Tracer v1.7.1 del mismo paquete, lo que indicó que las ejecuciones Monte Carlo de la cadena Markov habían convergido. Los filogramas se editaron y mostraron en el programa FigTree 1.4.1 del paquete Beast.

Se aplicaron alícuotas de tres microlitros de todas las poblaciones de cápside de AdSDV (~1 mg/mL) a rejillas de carbón perforado Quantifoil descargadas luminiscentemente con una fina capa de carbón (Quantifoil Micro Tools GmbH) y se vitrificaron utilizando un Vitrobot Mark IV (FEI) a 95ºC. % humedad y 4 °C. La calidad y la idoneidad de las rejillas para la recopilación de datos crio-EM se determinaron mediante detección con una cámara de dispositivo de carga acoplada de 16 megapíxeles (Gatan) en un microscopio electrónico de transmisión Tecnai G2 F20-TWIN operado a 200 kV en modo de dosis baja ( ∼20 e − /Å2) antes de la recopilación de datos. Para recopilar los conjuntos de datos EC1 y 2 de baja resolución, se utilizó el mismo microscopio a 50 cuadros por 10 s con un detector de electrones directos (DED) K2 en el núcleo de microscopía electrónica del Centro Interdisciplinario de Investigación Biotecnológica de la Universidad de Florida (RRID:SCR_019146) .

La recopilación de datos de alta resolución se llevó a cabo en dos ubicaciones: la Universidad Estatal de Florida (FSU) para las poblaciones ORF1-VLP, EC1 y EC2, y la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) para las cápsides EC y FC. En ambos casos se utilizó un microscopio electrónico Titan Krios (FEI), operando a 300 kV, equipado con un DED Gatan K3 en FSU y un DED Gatan K2 en UCLA. En UCLA, el telescopio también contenía un filtro de imágenes postcolumna Gatan y una rendija de paso libre de 20 eV. Los fotogramas de la película se grabaron utilizando las aplicaciones semiautomáticas Leginon v2.0 y v3.2 en ambos sitios59. En FSU, la velocidad de fotogramas fue de 50 por 10 s con una dosis de electrones de ∼60 e - /Å2. En UCLA, las imágenes se recolectaron a 50 fotogramas cada 10 s con una dosis de electrones de ~75 e − /Å2. Todos los fotogramas de la película se alinearon utilizando la aplicación MotionCor2 con ponderación de dosis60.

La reconstrucción de imágenes de una sola partícula se llevó a cabo mediante cisTEM v1.0.61. La calidad de las micrografías se evaluó mediante la estimación de CTF utilizando un tamaño de caja de 512. En el procesamiento posterior se incluyó un subconjunto de micrografías con los mejores valores de ajuste de CTF. El boxeo de partículas se realizó mediante la subrutina de selección de partículas, en un valor umbral de 2,0 a 4,0. Las partículas en cajas se seleccionaron mediante clasificación 2D, imponiendo simetría icosaédrica en 50 clases. Las clases de partículas que no mostraban un promedio 2D claro fueron eliminadas de la reconstrucción. La generación del modelo ab initio se llevó a cabo en 40 iteraciones bajo restricciones de simetría icosaédrica. El volumen de inicio obtenido fue sometido a refinamiento automático con simetría icosaédrica impuesta y sometido a iteraciones hasta alcanzar una resolución estable. Los mapas finales se lograron afinando en un factor B posterior al corte de 10 a 20. La resolución de los mapas obtenidos se calculó basándose en una correlación de capa de Fourier (FSC) de 0,143. Cada mapa fue redimensionado al tamaño de vóxel determinado en Chimera (maximizando el coeficiente de correlación) usando la subrutina e2proc3D.py en EMAN2 y luego convertido al formato CCP4 usando el programa MAPMAN v3.662. El modelo atómico del mapa ORF1-VLP se construyó directamente en la densidad, sin un modelo acoplado inicial, utilizando Coot63. Este modelo atómico se utilizó para construir la densidad de las otras cuatro reconstrucciones. Por último, cada modelo se refinó con respecto al mapa utilizando las subrutinas de refinamiento de cuerpo rígido, espacio real y factor B en Phenix64. La visualización de los mapas y modelos obtenidos se realizó mediante UCSF Chimera v1.13.1 y PYMOL v2.3.4.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las secuencias de ácidos nucleicos, generadas en este estudio, se depositaron en el NCBI GenBank con los números de acceso OP436269 y OP436270, para los segmentos ns y vp, respectivamente. Las secuencias de proteínas derivadas de este estudio se enviaron a la base de datos de proteínas no redundantes del NCBI con los números de acceso WDB01642, WDB01643, WDB01644, WDB01645 y WDB01646. Los mapas de densidad generados mediante microscopía crioelectrónica y reconstrucción de imágenes en 3D se depositaron en el banco de datos de microscopía electrónica, con los números de identificación EMD-28604, EMD-28550, EMD-28553, EMD-28605 y EMD-28607. Los modelos atómicos integrados en estos mapas de densidad están disponibles en el banco de datos de proteínas RCSB, con los números de identificación 8EU5, 8ER8, 8ERK, 8EU6, 8EU7. El estudio también utilizó los siguientes modelos atómicos disponibles públicamente del banco de datos de proteínas RCSB con números de identificación 1DNV, 3N7X, 4MGU, 3P0S, 6WH3, 2CAS y 1LP3. Los datos originales se proporcionan con este documento. Para los cálculos filogenéticos se utilizó la secuencia de la proteína NS1 de las especies tipo de todas las especies actualmente clasificadas de la familia Parvoviridae, derivadas de la base de datos de proteínas no redundantes del NCBI. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Los autores desean agradecer a la fallecida Dra. Mavis Agbandje-McKenna por sus estudios pioneros sobre las estructuras de la cápside del parvovirus. El estudio fue financiado por la subvención Discovery del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá (a PT) y una subvención NIH R01 NIH GM082946 (a RM). Los autores agradecen a Micheline Letarte de microscopía INRS AFSB y al núcleo de microscopía electrónica UF-ICBR por el acceso a los microscopios electrónicos utilizados para la microscopía electrónica de tinción negativa y la detección con micrografía crioelectrónica. Los microscopios crioelectrónicos Spirit y TF20 fueron proporcionados por la Facultad de Medicina (COM) y la División de Programas Patrocinados (DSP) de la UF. Agradecemos al Dr. Hong Zhou (Universidad de California, Los Ángeles) y al proyecto NIH “West/Midwest Consortium for High-Resolution Cryo Electron Microscopy” por el acceso al Centro de imágenes electrónicas para Nanomachines Titan Krios y K2 DED utilizados para datos de alta resolución. recopilación. La recopilación de datos en la Universidad Estatal de Florida fue posible gracias a las subvenciones NIH S10 RR025080-01 (PI Taylor) y U24 GM116788 The Southeastern Consortium for Microscopy of MacroMolecular Machines (PI Taylor). Los autores también agradecen a Kari Basso del Centro de Educación e Investigación sobre Espectrometría de Masas de la Universidad de Florida por el trabajo de espectrometría de masas, financiado por NIH S10 OD021758-01A1. Agradecemos la ayuda en la cría de insectos proporcionada por Martin Holm.

Judit J. Penzes

Dirección actual: Instituto de Biomedicina Cuantitativa, Rutgers, Universidad Estatal de Nueva Jersey, Piscataway, Nueva Jersey, 08854, EE. UU.

Hanh T Pham

Dirección actual: HTG Molecular Diagnostics, 3430 E Global Loop, Tucson, AZ, 85706, EE. UU.

Emmanuel W. Smith

Dirección actual: JEOL USA Inc., Peabody, MA, 01960, EE. UU.

Centro de Biotecnología de la Salud Armand-Frappier, Instituto Nacional de Investigación Científica, Laval, QC, H7V 1B7, Canadá

Judit J. Pénzes, Hanh T. Pham y Peter Tijssen

The McKnight Brain Institute, Universidad de Florida, Gainesville, FL, 32610, EE. UU.

Judit J. Pénzes, Paul Chipman y Robert McKenna

Instituto de Biofísica Molecular, Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, FL, 32306, EE. UU.

Emmanuel W. Smith

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Concebido y diseñado por: PT, JJP y RM Los datos fueron recopilados por: JJP, HTP, PC y EWS El análisis fue realizado por: JJP, HTP, PT, RM El manuscrito fue escrito por: JJP, RM, PT Todos los autores declaran han cumplido con la política de Inclusión y Ética de autoría del portafolio Nature.

Correspondencia a Judit J. Pénzes, Robert McKenna o Peter Tijssen.

Los autores no declaran ningún interés en conflicto.

Nature Communications agradece a Mart Krupovic, Bidadi Prasad y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Pénzes, JJ, Pham, HT, Chipman, P. et al. Genoma bipartito y organización estructural del parvovirus Acheta domesticus densovirus segmentado. Nat Comuna 14, 3515 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38875-x

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Recibido: 07 de noviembre de 2022

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 14 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38875-x

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