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Jun 27, 2023

SRAS

Virology Journal volumen 19, Número de artículo: 193 (2022) Citar este artículo 1540 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics Una pandemia global está en marcha causada por el síndrome respiratorio agudo severo

Revista de Virología volumen 19, Número de artículo: 193 (2022) Citar este artículo

1540 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

Está en marcha una pandemia mundial causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). El genoma del SARS-CoV-2, al igual que su predecesor, el SARS-CoV, contiene marcos de lectura abiertos que codifican proteínas accesorias involucradas en las interacciones virus-huésped activas durante la infección y que probablemente contribuyen a la patogénesis. Una de estas proteínas accesorias es la 7b, con solo 44 (SARS-CoV) y 43 (SARS-CoV-2) residuos. Tiene un dominio transmembrana predicho completamente conservado, lo que sugiere un papel funcional, mientras que la mayor variabilidad está contenida en el extremo C citoplasmático predicho. En el SARS-CoV, la proteína 7b se expresa en las células infectadas y el dominio transmembrana era necesario y suficiente para la localización en Golgi. Además, se han encontrado anticuerpos anti-p7b en el suero de pacientes convalecientes del SARS-CoV. En el presente estudio, hemos investigado la hipótesis de que la proteína 7b del SARS-2 forma oligómeros con actividad de canal iónico. Mostramos que en ambos virus del SARS, 7b es casi completamente α-helicoidal y tiene un único dominio transmembrana. En SDS, 7b forma varios oligómeros, desde monómeros hasta tetrámeros, pero solo monómeros cuando se exponen a reductores. La combinación de electroforesis en gel SDS y ultracentrifugación analítica (AUC) en los modos de equilibrio y velocidad sugiere un equilibrio dímero-tetrámero, pero un equilibrio monómero-dímero-tetrámero en presencia de reductor. Estos datos sugieren que, aunque pueden estar presentes dímeros unidos por enlaces disulfuro, no son esenciales para formar tetrámeros. La inclusión de pentámeros u oligómeros superiores en el modelo SARS-2 7b fue perjudicial para la calidad del ajuste. Se generaron modelos preliminares de esta asociación con AlphaFold2 y se expusieron dos modelos alternativos a una simulación de dinámica molecular en presencia de una membrana lipídica modelo. Sin embargo, ninguno de los dos modelos proporcionó ninguna vía evidente para los iones. Para confirmar esto, se estudió el SARS-2 p7b mediante electrofisiología plana bicapa. La adición de p7b a las membranas modelo produjo una permeabilización ocasional de la membrana, pero esto no fue consistente con canales iónicos genuinos hechos de un ensamblaje tetramérico de hélices α.

Los coronavirus (CoV) son patógenos de vertebrados que causan enfermedades respiratorias humanas que típicamente afectan el tracto respiratorio y el intestino. Se sabe que causan síntomas de resfriado común en humanos y una variedad de enfermedades letales en aves y mamíferos [1]. Sin embargo, en 2003, el virus responsable del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) [2], en adelante denominado SARS, produjo una casi pandemia con 8.098 infectados y 774 muertes, es decir, una tasa de mortalidad del 10% [3]. Actualmente, se está produciendo una pandemia mundial de la enfermedad por coronavirus 19, es decir, COVID-19 (https://www.who.int/health-topics/coronavirus) causada por el SARS-CoV-2, en adelante SARS-2 [4]. en marcha en el momento de escribir este manuscrito, infectando a 410 millones de personas y causando más de seis millones de muertes [5]. Es importante explorar urgentemente todas las posibles dianas terapéuticas farmacéuticamente accesibles en las proteínas del SARS-2 y las interacciones con el huésped [6]. Los CoV pertenecen a la familia Coronaviridae, subfamilia Coronavirinae, y se distribuyen en cuatro géneros [7]. En los genomas de CoV, los primeros dos tercios codifican genes no estructurales; Los marcos de lectura abiertos ORF1a y ORF1b producen poliproteínas pp1a y pp1ab, que se procesan en 16 proteínas no estructurales (nsp1 a 16). El último tercio del genoma alberga los ORF de las proteínas estructurales: espiga (S), envoltura (E), membrana (M) y nucleoproteína (N), y también otras proteínas denominadas "accesorias", que varían en número y secuencia. incluso entre CoV que pertenecen al mismo linaje [8,9,10].

Específicos para los SARS-CoV hay ocho ORF que codifican proteínas accesorias, a saber, los ORF 3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b [11, 12]. Aunque se ha considerado que estas proteínas no son esenciales para la replicación viral in vitro [13,14,15], se ha descubierto que varias de ellas participan en las interacciones virus-huésped durante la infección in vivo [13, 16]. Las proteínas accesorias pueden conferir ventajas biológicas al virus en el huésped natural y contribuir a la patogénesis [11]. En el SARS, se predijo que la proteína 7b (p7b en adelante) se traduciría mediante escaneo con fugas de un segundo ORF presente en el sgRNA7 del SARS-CoV [17], y la expresión se confirmó en células Vero infectadas [18]. Aunque no se han realizado experimentos para detectar la expresión de p7b en muestras de tejido de pacientes con SARS, la presencia de anticuerpos anti-p7b en el suero de pacientes convalecientes de SARS indica que es probable que p7b se exprese in vivo [19], y se ha informado que es presente en viriones purificados [18]. En el SARS, p7b tiene una longitud de 44 aminoácidos y se prevé que un polipéptido altamente hidrófobo abarque la membrana, con un extremo N luminal y un extremo C citoplasmático [18]. La localización de p7b es similar a la de p7a y se encuentra en todo el compartimento de Golgi tanto en células infectadas por SARS como en células transfectadas con ADNc de 7b [18]. Se incorpora al virión del SARS, pero no se detecta en la superficie celular de las células transfectadas [18]. Se encontró que el dominio transmembrana de p7b, específicamente los residuos 21–23 y 27–30, era necesario y suficiente para su localización en Golgi [20]. No se encontró que SARS ORF7b fuera esencial para la replicación in vitro o in vivo [15, 18, 21]. Sin embargo, un virus prototipo (cepa Frankfurt-I) aislado durante el brote de SARS de 2003 [22] tenía una deleción de 45 nt en el dominio transmembrana de ORF7b y una ventaja replicativa en algunas células [23], lo que sugiere un papel atenuante para p7b. Además, los estudios que utilizan ARNip específicos para sgRNA7 del SARS-CoV mostraron un silenciamiento de la expresión de 7a, 7b, 8a y 8b [24], lo que indica que p7a/p7b (y p8a/p8b) pueden desempeñar ciertas funciones durante el ciclo de replicación del SARS. Se ha demostrado que p7b puede inducir apoptosis en células infectadas [25], pero la importancia de esto en el ciclo de vida viral no está clara [26].

La actual pandemia mundial de COVID-19 es causada por el SARS-2 que, al igual que su predecesor, el SARS, también codifica proteínas accesorias. La secuencia de p7b en el SARS-2 es un residuo más corta (43 residuos) que la del SARS, y su dominio transmembrana previsto está completamente conservado (Fig. 1), lo que sugiere un papel funcional. En general, la identidad de secuencia es del 88 %, donde > 90 % de la variabilidad está contenida en el extremo C citoplasmático previsto. Recientemente, se ha demostrado que el SARS-2 p7b media la apoptosis en células mediadas por el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) [27]. Sin embargo, con la excepción de un estudio que muestra que el SARS-2 7b forma oligómeros en geles de SDS y una propuesta de un modelo pentamericano hipotético similar al fosfolambán, no hay más caracterizaciones experimentales de p7b disponibles en la literatura [28].

Secuencias de SARS2 y SARS p7b, donde se subraya el dominio transmembrana previsto (TMD)

En el presente estudio, hemos investigado la hipótesis de que el SARS-2 p7b forma oligómeros con actividad de canal iónico. El tamaño oligomérico se determinó por primera vez mediante ultracentrifugación analítica (AUC) en los modos de equilibrio de sedimentación (SE) y velocidad de sedimentación (SV), mientras que la posible actividad del canal se probó utilizando bicapas lipídicas planas. Finalmente, sugerimos un modelo preliminar para la interacción de los monómeros 7b obtenido mediante una simulación de dinámica molecular realizada en presencia de una membrana lipídica.

El SARS-2 p7b de 43 residuos de largo se obtuvo como un péptido crudo, sintetizado con un extremo C amidado y un extremo N libre (Genscript, EE. UU.). SARS p7b se sintetizó internamente con un extremo C amidado y un extremo N libre utilizando química de fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) en fase sólida asistida por microondas utilizando un sintetizador de péptidos de microondas Odyssey (corporación CEM, EE. UU.). La proteína se escindió de la resina con ácido trifluoroacético (TFA) y se liofilizó. Los péptidos se disolvieron en TFA (10 µl) seguido de dilución con acetonitrilo hasta una concentración final de 5 mg/ml. La solución se inyectó en una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento (RP-HPLC) de fase inversa C4-300 Å (Phenomenex, Cheshire, Reino Unido) conectada a un sistema de HPLC (Shimadzu, Japón). Los disolventes utilizados fueron el disolvente A: agua con 0,1% de TFA (v/v) y el disolvente B: isopropanol/acetonitrilo (4:1 v/v) con 0,1% de TFA (v/v). El péptido se eluyó con un gradiente lineal del 30 al 75 % de disolvente B. Las fracciones reunidas se liofilizaron y la pureza de las muestras se comprobó mediante MALDI-TOF MS. El dominio transmembrana (p7b-TM) se sintetizó y purificó de la misma forma.

La reconstitución de p7b en membranas lipídicas se realizó primero mezclando la proteína liofilizada en TFE con LPRm (relación molar de lípido a proteína) de 20 para lípido DMPC o 'mezcla de lípidos ERGIC' (POPC: POPE: PI bovino: POPS: colesterol, en una relación molar 45:20:13:7:15) en cloroformo. Los lípidos se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, EE. UU.). La mezcla se secó bajo una corriente de N2 y se incubó al vacío durante la noche antes de resuspendirla en agua mediante agitación vorticial y congelación-descongelación. La reconstitución de 7b-TM se logró mezclando lípidos y péptidos disueltos en etanol. Luego se evaporó el disolvente con N2 gaseoso y la muestra se rehidrató en agua.

Los espectros FTIR se registraron en un espectrómetro Nicolet Nexus 560 (Madison, EE. UU.) purgado con N2 y equipado con un detector MCT/A enfriado con nitrógeno líquido. Los espectros de reflexión total atenuada (ATR) se midieron con un accesorio ATR de 25 reflexiones de Graseby Specac (Kent, Reino Unido) y un polarizador de rejilla de alambre (0,25 mM, Graseby Specac). Se aplicaron aproximadamente 100 μl de muestra en agua a una relación molar LPR de 20: 1 sobre un elemento de reflexión interna (IRE) de Ge trapezoidal (50 × 2 × 20 mm). Se usó una corriente de N2 seca o saturada con D2O que fluía a través del compartimiento ATR para eliminar el agua en masa o para lograr el intercambio de D2O, respectivamente. Se promediaron un total de 200 interferogramas recolectados con una resolución de 4 cm-1 para cada muestra y se procesaron con llenado de un punto cero y apodización de Happ-Genzel. El% de aminoácidos incrustados en la membrana se obtuvo a partir de un experimento de intercambio de hidrógeno-deuterio de amida, donde la película de lípidos/proteínas se sometió a un flujo de nitrógeno saturado con D2O durante 30 minutos. El área de las bandas de amida II (flexión N-H, centrada en ~ 1550 cm-1) y amida I (estiramiento C=O, centrada en ~ 1655 cm-1) se obtuvo mediante integración de picos de 1510 a 1590 cm-1. y 1600 a 1700 cm-1 La fracción de residuos no intercambiados se determinó como se describió anteriormente [29].

Las muestras de péptidos se solubilizaron en tampón de muestra NuPAGE, con o sin reductor, Tris (2-carboxietil) -fosfina (TCEP) o ditiotreitol (DTT) 5 mM, y se procesaron en un gel Bis-Tris al 13,5% siguiendo el protocolo NuPAGE (Invitrogen , Termo Fisher Scientific). El gel se tiñó con azul de Coomassie G-250.

Los experimentos de velocidad de sedimentación AUC (AUC-SV) se realizaron utilizando una ultracentrífuga analítica Beckman ProteomeLab XL-I con un rotor An-50Ti. Las muestras de p7b se reconstituyeron en miristilsulfobetaína 5 mM (C14SB, Sigma), Tris 50 mM, pH 7,3 y NaCl 100 mM, con o sin adición de TCEP 2 mM, y en presencia de D2O al 29,4% (v/v) para eliminar la flotabilidad del detergente. . Las muestras se centrifugaron a 50.000 rpm en células AUC centrales de 2 sectores epon con ventanas de cuarzo. El perfil de absorbancia a 280 nm se recogió cada 10 min durante 15 h. Los perfiles de sedimentación se analizaron en SEDFIT utilizando el modelo c(s) [30] y se representaron con GUSSI [31]. Los valores S correspondientes al monómero, dímero o tetrámero de p7b en micelas C14SB se predijeron considerando las propiedades del detergente, la proteína y la composición del tampón. El peso molecular (MW), el número de agregación y el volumen específico del detergente C14SB fueron 363,6 Da, 83–130 (www.anatrace.com) y 0,965–0,978 ml/g (según nuestros datos de coincidencia de densidad), respectivamente. Usando la secuencia de SARS2-7b, el PM es 5180 Da y el volumen específico es 0,7702 ml/g (calculado usando el software Sednterp). La densidad y viscosidad del tampón (Tris 50 mM, NaCl 100 mM y D2O al 29,4%) fue ρ = 1,0353 g/mL y η = 1,0997 cP (calculado usando el software Sednterp), respectivamente. Suponiendo la estimación más baja para el número de moléculas de detergente unidas y la estimación más baja del volumen específico de C14SB (νD) y el volumen específico más bajo de la micela (νc), el peso del complejo micelar (MC), la fracción de masa del detergente (δD) , se puede calcular la masa de flotabilidad (Mb) y el valor S esperado (Tabla 1). Se puede calcular un límite inferior para S para monómero, dímero y trímero considerando el número de agregación más alto y el volumen específico del detergente: 0,13 S, 0,43 S y 0,99 S, respectivamente (última columna en la Tabla 1).

Se realizaron experimentos de equilibrio de sedimentación AUC (AUC-SE) para muestras 7b y 7b-TM en las mismas condiciones de instrumento, rotor y tampón que las muestras AUC-SV. Para cada muestra, se prepararon tres concentraciones (30, 55 y 100 µM) y se centrifugaron a cuatro velocidades (23.000, 28.000, 34.500 y 42.000 rpm) en células AUC centrales de epon de 6 sectores con ventanas de cuarzo. La absorbancia a 280 nm se midió después de 24 h de equilibrio a cada velocidad (la confirmación del perfil de equilibrio se obtuvo después de realizar exploraciones a intervalos de 30 min). Una vez obtenidos, los perfiles de sedimentación se probaron con varios modelos de autoasociación (SEDPHAT) y se representaron en GUSSI [31, 32].

La gráfica de población de especies se dibujó en escala de fracción molar calculando la constante de asociación de escala de fracción molar KX como se describe [33], usando la expresión: \({K}_{X}={K}_{A,app}\times [Det]\) donde KA,app es la constante de asociación ajustada en escala molar masiva, y [Det] es la concentración de detergente micelar en solución. Para el equilibrio monómero-dímero-tetrámero, la fracción molar de cada especie en la fase detergente: X4, X2 y X1 (tetrámero, dímero y monómero, respectivamente) se calculó resolviendo la siguiente expresión para X1 utilizando el método de Newton-Raphson. método:

donde KX,24 y KX,12 son las constantes de asociación de escala de fracción molar para el equilibrio dímero-tetrámero y monómero-dímero, respectivamente, y Xt es la fracción molar de proteína total en la fase detergente. Para el equilibrio dímero-tetrámero, las fracciones molares se calcularon de manera similar resolviendo la siguiente expresión para X2:

El modelo dimérico de SARS-2 p7b se construyó utilizando el servidor AlphaFold2 [34] (https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb), suponiendo una estructura helicoidal α y alineación paralela de los monómeros. La distancia entre los dos átomos de azufre de dos residuos de cisteína de TM (Cys12) se estableció para que fuera lo suficientemente cercana como para formar un enlace disulfuro. Para construir las estructuras iniciales del tetrámero se consideraron dos posibilidades para orientar los dos homodímeros, dando como resultado dos modelos tetraméricos diferentes. Los dos dímeros se separaron 0,85 nm para evitar choques y se colocaron dentro de una bicapa lipídica de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC). Se eliminaron las moléculas de lípidos que formaban estrechos contactos con la proteína tetrámera. Los parámetros de las proteínas se basaron en el campo de fuerza AMBER99SB-ILDN [35]. El campo de fuerza lipídico utilizado es el slípido, un campo de fuerza totalmente atómico para membranas biológicas [36, 37]. El sistema se solvató con moléculas de agua TIP3P [38] y se agregaron contraiones para neutralizar el sistema. Las simulaciones de dinámica molecular (MD) se realizaron utilizando el software GROMACS [39] 5.1.2. Se utilizó el algoritmo LINCS [40] para restringir los enlaces entre átomos pesados ​​e hidrógeno para permitir un paso de tiempo de 2 fs. Se utilizó un límite de 1,2 nm para los cálculos de interacción de Van der Waals y de interacción electrostática de corto alcance, y se implementó el método Particle Mesh Ewald para cálculos electrostáticos de largo alcance. La temperatura de simulación se mantuvo a 300 K usando un termostato de reescala V [41] y una presión de 1 bar usando un barostato Parrinello-Rahman [42]. Se realizaron simulaciones de 100 ns para ambos tetrámeros en presencia de la bicapa lipídica POPC.

Se formaron bicapas planas mediante la aposición de dos monocapas preparadas a partir de una solución de 5 mg/ml de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina pura (DPhPC) (Avanti polar lipids, Inc., Alabaster, AL) en pentano. Se agregaron lípidos a un orificio de ~ 100 μm de diámetro en la partición de teflón de 15 μm de espesor que separaba dos cámaras idénticas [43, 44]. El orificio se pretrató con una solución al 3% de hexadecano en pentano. Las soluciones acuosas consistían en KCl 1 M tamponado con HEPES 5 mM a pH = 6. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente (23 ± 1 °C). Se observaron eventos actuales después de agregar 0,5–1 μL de una solución de 2,5 mg/mL de SARS-2 p7b en acetonitrilo: H2O (1:1 v/v) (ACN 50%) a un lado de la cámara (lado cis). Las adiciones se realizaron cerca del orificio y luego se reformó la membrana para promover la incorporación de proteínas en la bicapa lipídica. Las sucesivas adiciones de proteínas promovieron siempre el mismo tipo de acontecimientos actuales. Se aplicó un potencial eléctrico utilizando electrodos de Ag/AgCl en KCl 2 M con puentes de agarosa al 1,5% ensamblados dentro de puntas de pipeta estándar de 250 μL. El potencial se definió como positivo cuando era mayor en el lado de la adición de proteínas (lado cis), mientras que el lado trans estaba puesto a tierra. Se utilizó un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en modo de abrazadera de voltaje para medir la corriente y el potencial aplicado. Los datos se filtraron mediante un filtro Bessel de paso bajo integrado de 8 polos a 10 kHz, se digitalizaron a una frecuencia de muestreo de 50 kHz con un Digidata 1440A (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se analizaron utilizando el software pClamp 10.7 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). CALIFORNIA). La cámara y el escenario principal se aislaron de fuentes de ruido externas con una doble pantalla metálica (Amuneal Manufacturing Corp., Filadelfia, PA).

Cuando se eliminó el agua en masa, el espectro infrarrojo de p7b reconstituido en bicapas lipídicas similares a ERGIC mostró una banda de amida I estrecha y altamente simétrica centrada en 1656 cm-1, comparable al espectro de p7b-TM (Fig. 2). Esto corresponde a una conformación completamente helicoidal α. Sin embargo, la hidratación de las membranas con D2O produjo un espectro con un hombro de alrededor de 1.630 cm-1, lo que sugiere una propensión a la formación de estructuras β [45], posiblemente localizada en el dominio extramembrana C-terminal. El intercambio hidrógeno-deuterio (H/D) reduce el área de la amida I, manteniendo constante la amida I. A partir de la relación entre estas dos áreas antes y después de la adición de D2O, calculamos aproximadamente 23 aminoácidos resistentes al intercambio H/D, lo que coincide con un dominio TM único predicho (ver Fig. 1). Se obtuvieron resultados similares con SARS p7b y no se muestran.

Espectros de absorbancia ATR-FTIR de SARS-2 p7b reconstituido en bicapas lipídicas tipo ERGIC/Golgi. Espectros ATR-FTIR de p7b reconstituido en bicapas lipídicas ERGIC hidratadas con H2O (azul) y D2O (rojo). A modo de comparación, también se muestra el espectro 100% de hélice α de p7b-TM (verde)

Dado que p7b tiene dos residuos de cisteína, uno en el TMD y otro en el dominio extramembrana (Fig. 1), probamos si el patrón de migración en SDS se vio afectado por los reductores. En condiciones no reductoras (- TCEP), se observaron múltiples oligómeros 7b, desde dímeros hasta tetrámeros (Fig. 3, izquierda). En condiciones reductoras (+ TCEP), solo se detectaron monómeros (Fig. 3, derecha). Se observó un patrón similar para el SARS 7b, donde los oligómeros superiores desaparecieron en presencia de TDT (archivo adicional 1: Fig. S1). El TMD solo, que tiene un solo residuo de cisteína, formó solo monómeros y dímeros en las mismas condiciones (archivo adicional 1: Fig. S1). Por tanto, esto confirma la presencia de enlaces disulfuro en p7b, que pueden tener un efecto sobre la oligomerización.

p7b forma oligómeros mediados por disulfuro. SDS-PAGE de SARS-2 p7b sin TCEP (carriles 1 a 3) o con TCEP (carriles 5 a 7). Los números indican los µg utilizados. El estado oligomérico estimado se indica mediante puntos.

El comportamiento de oligomerización de p7b se examinó más a fondo utilizando el equilibrio de sedimentación (SE), donde los perfiles de distribución radial se ajustaron a varios modelos de autoasociación. En esta técnica, la densidad del componente detergente de la muestra se iguala utilizando D2O, y el comportamiento depende exclusivamente del peso molecular del complejo proteico, no de su forma. Los perfiles de sedimentación (Fig. 4A) se equiparon con varios modelos. Después de una búsqueda exhaustiva, el mejor ajuste se obtuvo con un equilibrio monómero-dímero-tetrámero (1–2–4), pero también monómero-tetrámero (1–4) y dímero-tetrámero (2–4). Dado que los monómeros solo se observaron en presencia de TCEP en SDS (Fig. 3), proponemos que el modelo 2-4 sea el más probable. En presencia de TCEP (Fig. 4B), se observó un resultado similar. Dado que los monómeros se observan claramente en SDS, en este caso elegimos el modelo 1–2–4. La distribución de estas especies dependiendo de la relación proteína-detergente se muestra en la Fig. 4C, calculada utilizando el protocolo descrito anteriormente [46, 47]. Estos datos indican que la formación de tetrámeros no requiere la presencia de dímeros unidos por enlaces disulfuro, aunque se desconoce si los tetrámeros con o sin enlaces disulfuro son idénticos (Tabla 2).

Perfil de equilibrio de sedimentación de SARS-2 p7b en detergente C14SB. Un perfil de distribución radial de varias velocidades de p7b en detergente C14SB (círculos). Los modelos de autoasociación de mejor ajuste se superponen como líneas continuas en los paneles superiores y los residuos de ajuste se muestran en los paneles inferiores. El chi-cuadrado reducido global de cada modelo ajustado se muestra en el gráfico de barras del lado derecho, donde los números en los ejes x indican el modelo ajustado en cada caso, y los mejores modelos están resaltados en amarillo; B igual que A para p7b en presencia de TCEP 2 mM; Distribución de la población del monómero C de p7b en especies oligoméricas indicada en ausencia (línea continua) y presencia de TCEP (línea de puntos). Los ejes x indican la concentración de monómero y la relación molar detergente/proteína. Se indican las condiciones utilizadas en SE (intervalo de condiciones)

Para 7b-TM, los mejores ajustes fueron 1–2, 1–3 y 2–4, pero en presencia de TCEP, el modelo 1–2 fue mejor que los otros dos, posiblemente debido a la mayor disponibilidad de monómero en esta muestra ( Figura 5A). Esto último sugiere que el dominio TM por sí solo puede impulsar la dimerización incluso en ausencia de enlaces disulfuro, pero la tetramerización en p7b-TM (si la hay) probablemente requiera la formación de dímeros unidos por enlaces disulfuro a través de Cys12. Las diferencias entre los dos casos pueden deberse a un aumento en la concentración del dímero cuando se forman enlaces disulfuro, o a un modo de interacción más favorable entre las hélices del dímero. Utilizando el SARS 7b de longitud completa, la formación de tetrámeros no requiere la formación de enlaces disulfuro (Fig. 5B) y la comparación de SARS p7b TM y p7b en presencia de TCEP sugiere que los monómeros son más abundantes en el primer caso. En general, esto sugiere (i) una contribución significativa a una mayor estabilidad de los oligómeros (tetrámeros) de los dominios extramembrana y (ii) la orientación hélice-hélice en el dímero puede ser la misma, con o sin enlaces disulfuro.

Modelos de oligomerización para p7b-TM y SARS p7b en detergente C14SB. A A partir de los perfiles de distribución radial de múltiples velocidades de p7b-TM (archivo adicional 1: Fig. S2A), se probaron los modelos de autoasociación de mejor ajuste y el chi-cuadrado reducido global de cada modelo ajustado se muestra en ausencia (-TCEP ) y presencia (+ TCEP) de TCEP 2 mM; B lo mismo para SARS p7b (archivo adicional 1: Fig. S2B). Los números en el eje x indican el modelo montado en cada caso y los mejores modelos están resaltados en amarillo

Aunque SE es el estándar de oro de AUC para determinar los pesos moleculares de las proteínas de membrana, la ambigüedad en los modelos propuestos sugirió el uso de SV para complementar los datos de SE. En ausencia de TCEP reductor, SARS-2 p7b produjo dos bandas en el perfil de distribución c(s) (Fig. 6A), una a ~ 0,55 S, consistente con el tamaño de un dímero (2-mero) y la otra a 1,1 S consistente con una forma tetramérica (4-mer). Esto último es, en principio, coherente con los resultados del SE (Fig. 4). En presencia de TCEP, el tetrámero propuesto (1,1 S) desapareció y las especies de S inferior cambiaron a ~ 0,5 S, lo que aún es consistente con un dímero. Sin embargo, observamos que una sola banda en el gráfico c(s) también puede indicar un equilibrio rápido entre especies más pequeñas y más grandes [48], por lo que un equilibrio rápido entre monómeros, dímeros y tetrámeros sigue siendo compatible con estos datos. En cualquier caso, esto indica que la oligomerización no requiere estrictamente la formación de enlaces disulfuro. El hecho de que esta banda esté ligeramente desplazada en relación con la condición sin TCEP sugiere además que puede representar, no un dímero, sino un equilibrio rápido entre el monómero, el dímero y el tetrámero [48]. Así, surgen dos modelos posibles en los que un tetrámero está formado por dos dímeros: (i) en uno, los enlaces disulfuro provocan la formación de dímero, antes de la formación del tetrámero; (ii) en el otro, la interacción entre los dímeros es no covalente, mientras que los enlaces disulfuro unen dos dímeros. También se observó un patrón similar de dímeros y tetrámeros en el caso del SARS p7b (Fig. 6B). Aquí, el resultado fue ligeramente diferente porque la banda S más grande estaba ubicada en la región 'trímera'. Como se analizó anteriormente, esto nuevamente es consistente con una especie intermedia resultante del rápido intercambio entre dímeros y tetrámeros, lo que refleja las diferencias del dominio extramembrana entre estas dos secuencias y respalda aún más que el dominio extramembrana está involucrado en la formación de estos oligómeros.

Perfil de velocidad de sedimentación de SARS-2 y SARS p7b en detergente C14SB. (A) Comparación de la distribución c(s) obtenida con (rojo) o sin reductor TCEP (negro). Los rectángulos grises indican el rango de valores S calculados para un monómero, dímero y tetrámero de p7b (consulte la sección Métodos); (B) lo mismo para el SARS p7b

Generamos dímeros unidos por Cys 12 en AlphaFold y ninguno de estos modelos tetraméricos (Fig. 7) produjo una estructura compatible con un canal (https://mole.upol.cz/).

Modelos de homotetrámero 7b-TM. A – B Dos modelos tetraméricos obtenidos mediante la interacción de dos dímeros unidos por enlaces disulfuro (amarillo). Los dímeros se obtuvieron con Alpha-Fold, mientras que el tetrámero se embebió en una membrana POPC; C el diámetro de los poros llega a cero en varias partes a lo largo del canal para ambos modelos (panel inferior)

Se utilizó electrofisiología de membrana plana para probar la capacidad de longitud completa del p7b del SARS-2 para formar canales en bicapas lipídicas. La adición de la proteína diluida en ACN al 50% indujo solo grandes corrientes inestables ocasionales que duraron más de minutos y presentaron transiciones de corriente escalonadas (Fig. 8). En general, estas corrientes no produjeron rotura de membrana. Se observó actividad de corriente inducida por p7b a voltajes aplicados que oscilaban entre ± 10 y ± 100 mV. Los experimentos de control con ACN al 50% solo no produjeron ningún efecto sobre la membrana. La conductancia (G = I/V) medida durante los eventos de permeabilización de la membrana inducida por p7b fue de varios nanoSiemens, con pasos de conductancia típicos de 1 a 5 nS (Fig. 8). Conductancias tan altas son comparables a las medidas en porinas anchas con diámetros de 1 a 2 nm [49, 50]. Sin embargo, la inestabilidad observada en las corrientes inducidas por p7b no se parece a la de las porinas u otras proteínas formadoras de canales, como la proteína E del SARS-CoV-2 [51], que muestran corrientes más silenciosas. Una explicación para la aparición de niveles de corriente transitorios tan grandes, tal vez relacionados con una alta relación proteína/lípidos, que promueve una acción similar a la de un detergente [52], está fuera del alcance del presente trabajo. Por lo tanto, la permeabilización de la bicapa inducida por p7b observada evidencia que la proteína interactúa con las membranas lipídicas, pero es difícilmente compatible con la existencia de canales iónicos genuinos basados ​​en un ensamblaje tetramérico con varios residuos hidrofóbicos que recubren el poro estrecho.

Ocasionalmente permeabilización de la membrana lipídica por p7b. Registros de corriente representativos con voltaje aplicado + 100 mV después de la adición de p7b a las membranas lipídicas planas DPhPC. Las grabaciones se filtraron digitalmente con un filtro Bessel de paso bajo de 8 polos con una frecuencia de corte de 500 Hz.

El papel preciso durante la infección de las proteínas accesorias específicas de un grupo codificadas por los SARS-CoV aún no se comprende del todo. Sin embargo, dado que los genomas del SARS-CoV codifican la mayor cantidad de proteínas accesorias entre los coronavirus, resulta tentador especular que desempeñan algún papel importante en la manifestación clínica de la infección. Los SARS-CoV 3a, 6, 7a y 7b tienen dominios transmembrana [18, 26, 53, 54]. 7a tiene una alta similitud estructural con las proteínas de la superfamilia tipo Ig, aunque no hay una homología de secuencia significativa [55, 56], mientras que 3a forma canales iónicos tetraméricos [57] con una estructura en nanodiscos de lípidos resuelta recientemente usando crio-EM [58]. En el presente estudio hemos investigado el comportamiento de p7b en entornos lipídicos y detergentes para evaluar si forma oligómeros con propiedades de canal iónico. En general, la conclusión de nuestros datos es que p7b es predominantemente α-helicoidal, aunque el dominio extramembrana puede formar algunas cadenas β. Este último dominio probablemente contribuye a la estabilidad de los oligómeros.

Aunque se observan oligómeros en SDS, este es un detergente fuerte y no es un entorno adecuado para estudiar el ensamblaje de las hélices α. Sin embargo, está claro que no hay monómeros presentes en ausencia de reductor. Esto elimina los modelos que involucran monómeros al instalar perfiles de sedimentación SE que usan el detergente más suave C14SB. Por tanto, sugerimos que el modelo más probable es un equilibrio entre dímeros y tetrámeros. Cuando hay un reductor presente, solo se observaron monómeros en SDS y también se observaron cambios claros en los experimentos de SV. Esto confirma que hay enlaces disulfuro en la muestra y que la interrupción de estos enlaces afecta la oligomerización, pero no previene la formación de tetrámeros, ya que el mejor modelo en AUC SE es 1–2–4. Aquí, el modelo puede complicarse al tener dos tipos de dímeros (unidos o no unidos por enlaces disulfuro), una pequeña contribución de trímeros u oligómeros más grandes, una contribución del propio TCEP, etc. Sin embargo, creemos que está fuera del alcance de este artículo caracterizar más a fondo un comportamiento tan complejo.

Aunque la participación, pero no el requisito, de los enlaces disulfuro en la oligomerización recuerda a la del canal de protones M2 del virus de la influenza A, no se detectó ninguna vía de poros en ninguno de los modelos tetraméricos propuestos. Además, esto está respaldado experimentalmente ya que la actividad eléctrica detectada en las bicapas estándar no era consistente con un poro tetramérico muy estrecho, lo que sugiere que p7b no forma canales iónicos auténticos. En general, la presencia de dímero resistente a DTT en electroforesis en gel y en experimentos de SE en presencia de reductor sugiere que la dimerización no requiere la formación de enlaces disulfuro, aunque este último puede estabilizarla. En un sistema similar, se sugirió que el residuo de cisteína en el dominio transmembrana ζζ estabilizara la forma dimérica, solo después de la formación de la interfaz adecuada [59]. En general, el papel desempeñado por p7b en el ciclo de vida viral y durante la infección por SARS-CoV aún no está claro, pero brindamos una primera visión de su comportamiento oligomerizante.

Los datos se compartirán previa solicitud razonable al autor correspondiente.

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MQ y VA agradecen el apoyo del Gobierno de España MCIN/AEI/http://dx.doi.org/10.13039/501100011033 (proyecto nº 2019-108434GB-I00 AEI/FEDER, UE e IJC2018-035283-I/AEI) y Universitat Jaume I (proyecto nº UJI-A2020-21). Agradecemos a Siok Wan Gan y Cin Huang Soon por la purificación de SARS p7b y p7b-TM.

“Esta investigación cuenta con el apoyo del Ministerio de Educación de Singapur, en el marco de su Fondo de Investigación Académica de Nivel 1 (Proyecto RG92/21) para JT.). MQ y VA reconocen el apoyo del Gobierno de España MCIN/AEI/ http://dx.doi.org/10.13039/501100011033 (proyecto nº 2019-108434 GB-I00 AEI/FEDER, UE e IJC2018-035283-I/AEI ) y Universitat Jaume I (proyecto nº UJI-A2020-21).

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Tecnológica de Nanyang, 60 Nanyang Drive, Singapur, 637551, Singapur

Wahyu Surya, Yuguang Mu & Jaume Torres

Laboratory of Molecular Biophysics, Department of Physics, Universidad Jaume I, 12080, Castellón, Spain

Maria Queralt-Martin & Vicente M. Aguilella

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WS purificó los péptidos y realizó la mayoría de los experimentos, analizó los datos y contribuyó a escribir el manuscrito; MQ realizó los experimentos de actividad del canal y MY realizó la simulación. VA contribuye al análisis del canal y a la redacción del manuscrito. JT conceptualizó el proyecto, analizó datos y escribió el manuscrito. Todos los autores aprovaron el manuscrito final.

Correspondence to Jaume Torres.

No aplica.

Todos los autores han revisado el manuscrito antes de su envío.

Todos los autores declaran no tener intereses en competencia.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Electroforesis SDS-PAGE de SARS-1 p7b-TM y p7b, con o sin TDT. Los péptidos se sometieron a SDS-PAGE utilizando gel de tricina prefabricado al 16,5 % (Bio-Rad), con o sin 1,4-ditiotreitol (DTT). Se añadió tampón de muestra SDS al péptido liofilizado hasta una concentración final de 2 µg/uL. La muestra se mezcló con tampón de muestra durante 1 min y luego se calentó a 95 °C durante 5 min antes de cargarla en el gel. El gel se ejecutó a un voltaje constante de 80 V durante 3 h a temperatura ambiente. Los marcadores de masa molecular se obtuvieron de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific). El gel se tiñó con azul de Coomassie. Los carriles izquierdos son p7b-TM; el carril 3 es un marcador de masa molecular; los carriles 4-5 son p7b. Figura S2. Perfil de equilibrio de sedimentación de SARS1 7b-TM y 7b en detergente C14SB. Un perfil de distribución radial de 7b-TM en C14SB a 28000 rpm (círculos rojos), 34500 rpm (círculos verdes) y 42000 rpm (círculos azules). La presencia de TCEP se indica en los paneles respectivos. Los modelos de autoasociación de mejor ajuste se superponen como líneas continuas en los paneles superiores y los residuos de ajuste se muestran en los paneles inferiores. El modelo de mejor ajuste para 7b-TM sin TCEP fue un dímero-tetrámero mientras que con TCEP fue un monómero-dímero; B Lo mismo que A para SARS1 7b, donde el modelo que mejor se ajustaba era un monómero-dímero-tetrámero con o sin TCEP. Observamos que a veces los residuos de ajuste no se distribuyen aleatoriamente ni siquiera en el modelo de mejor ajuste. Esto indica que todavía podría haber una pequeña cantidad de otras especies no contabilizadas, posiblemente especies intermedias (p. ej., trímero) u oligómeros de orden superior (p. ej., octámero), que son demasiado complejos para modelarlos junto con el dímero y el tetrámero.

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Surya, W., Queralt-Martin, M., Mu, Y. et al. SARS-CoV-2 accessory protein 7b forms homotetramers in detergent. Virol J 19, 193 (2022). https://doi.org/10.1186/s12985-022-01920-0

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Recibido: 21 de septiembre de 2022

Aceptado: 04 de noviembre de 2022

Publicado: 21 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01920-0

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